D13S317基因座“off-ladder”等位基因分析

黃洪武，徐振亮，朱詣琦

(江蘇省昆山市公安局，江蘇 昆山 215300)

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)是廣泛存在于人類基因組中的一類具有高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記。其核心序列(重復(fù)單位)的重復(fù)數(shù)目存在差異,一般每個位點有近十個到十幾個等位基因，以孟德爾共顯性方式遺傳，在人類基因組中，大約每隔6～10 kb就出現(xiàn)一個STR位點[1]。STR分型具有檢測靈敏度高，適宜微量、腐敗降解材料鑒定的優(yōu)點[2]，憑借其操作簡單、便于控制及標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)，成為國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點及第二代法醫(yī)DNA分型技術(shù)的核心[3-4]。隨著STR遺傳標(biāo)記的廣泛使用，稀有等位基因的出現(xiàn)逐步增多[5-6]，D13S317是位于人類第13號染色體長臂的簡單四核苷酸序列重復(fù)的STR基因座，其重復(fù)單位為TATC，核心重復(fù)次數(shù)為7～15次。本研究分析了AGCU 17+1 STR熒光檢測試劑盒進(jìn)行STR分型時D13S317基因座檢出的“off-ladder”(OL)等位基因，對樣品進(jìn)行了單基因座擴增和測序，并確認(rèn)該基因座等位基因為稀有等位基因。

1 材料與方法

1.1 血樣 DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)過程中的個體血樣。

1.2 主要試劑及儀器 ABI 3130毛細(xì)管測序儀(ABI公司)，PCR儀(博日公司)，凝膠電泳系統(tǒng)(北京六一儀器)，Chelex-100(Bio-rad公司)，AGCU 17+1 STR熒光檢測試劑盒(AGCU公司)，LB平板培養(yǎng)基，5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠。

1.3 方法 (1)DNA提取：采用Chelex-100法制備基因組DNA[7]。(2)D13S317位點大片段克隆引物設(shè)計：F：5′-GCAGGAAATAGATGGGATCAAA -3′，R：5′-AATCTCCTCCTTCAACTTGGG-3′。(3) PCR擴增：在25 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行，PCR管反應(yīng)液含2.5×Reaction Mixture 10 μl。20 μmol/L引物混合物0.3 μl，5 U/μl熱啟動Taq酶0.25 μl，模板DNA 4.0 μl，ddH2O 10.3 μl，冰上操作。擴增程序：95 ℃預(yù)變性11 min，94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后60 ℃延伸60 min，擴增產(chǎn)物于4 ℃保存。(4)PCR產(chǎn)物檢測：PCR擴增產(chǎn)物用膠濃度為6%，交聯(lián)度為5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，垂直型電泳，銀染顯示電泳譜帶。(5)PCR產(chǎn)物TA克隆：PCR擴增產(chǎn)物按Bio-Basic pUCm-T Vector操作手冊與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板培養(yǎng)基(含氨芐青霉素、IPTG、X-Gal)，37 ℃培養(yǎng)14～16 h，篩選白色陽性克隆菌落。(6)目的克隆篩選：將篩選的陽性克隆培養(yǎng)成菌液進(jìn)行PCR擴增。菌液PCR擴增體系：在20 μl反應(yīng)體系中進(jìn)行，PCR管反應(yīng)液含2.5×Reaction Mixture 8 μl。20 μmol/L引物混合物0.2 μl，5 U/μl熱啟動Taq酶0.2 μl，模板DNA 2.0 μl，ddH2O 10 μl，冰上操作。擴增程序：95 ℃預(yù)變性11 min，94 ℃變性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后60 ℃延伸60 min，擴增產(chǎn)物于4 ℃保存。(7)電泳檢測及測序：擴增產(chǎn)物通過ABI 3130遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，收集電泳信息，得到含目的等位基因的克隆并送上海生工測序。

2 結(jié)果

2.1 D13S317基因座“OL”等位基因分型結(jié)果 用AGCU 17+1 STR熒光檢測試劑盒進(jìn)行17個STR位點檢測，其中D13S317基因座分型結(jié)果中出現(xiàn)等位基因11和一個“OL”等位基因，該OL等位基因在Allelic Ladder(7～15)前約4 bp處出現(xiàn)，見圖1。

圖1 D13S317基因座“OL”等位基因

2.2 D13S317基因座“OL”等位基因測序結(jié)果 D13S317基因座定位于人類染色體13q22-q31，核心重復(fù)序列為[TATC]，核心重復(fù)次數(shù)為7～15次，等位基因片段長度大小范圍為165～197 bp。AGCU 17+1 STR熒光檢測試劑盒中D13S317基因座的Allelic Ladder含有等位基因8～15。測序結(jié)果顯示：新發(fā)現(xiàn)的OL等位基因只含有6個[TATC]重復(fù)，是一個新的等位基因。該等位基因不在D13S317基因座常見基因型范圍之內(nèi)，所以標(biāo)示為OL峰。見圖2。

注：方框部分為熒光檢測引物結(jié)合區(qū)；斜體部分為核心重復(fù)區(qū)圖2 D13S317基因座OL等位基因序列比對結(jié)果

3 討論

通常Allelic Ladder包含大部分的常見等位基因片段[8]，而STR分型過程中碰到基因座位于Allelic Ladder范圍之外的即OL等位基因，對分型結(jié)果的解讀產(chǎn)生影響，這類OL等位基因的形成主要有兩種類型：一類是出現(xiàn)在Ladder中的兩個等位基因之間；另一類是超出Ladder范圍[9]。對于OL等位基因的出現(xiàn)，可以通過將擴增產(chǎn)物再次電泳、重新擴增樣本或用單基因座引物擴增來確證[10]。本研究利用單基因座引物擴增的方法得到含有一個“正?！钡任换蚝鸵粋€OL等位基因的分型結(jié)果。所檢測出的OL等位基因在Ladder(7～15)范圍之外，小于最小的Allelic Ladder，屬于第2種類型。根據(jù)樣本等位基因的位置與Ladder 中等位基因的大小(bp值)對比得出該OL等位基因在Ladder(7～15)前約4 bp處，大小在161 bp，結(jié)合測序技術(shù)進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)該OL等位基因只含有6個[TATC]重復(fù)，推測分型結(jié)果中OL等位基因的出現(xiàn)的原因是較低頻率的基因，即稀有等位基因的出現(xiàn)。

稀有等位基因是指人群中頻率極低的等位基因[11-12]。D13S317基因座位于13號染色體長臂的簡單TATC四核苷酸重復(fù)，其常見等位基因包含7～15個核心重復(fù)序列，也有報道顯示存在等位基因5、6、16。研究表明中國人群中D13S317基因座常見等位基因分布為7～14，基因頻率分布中等位基因8和11分布處于較高水平[13]，本研究[10]所得出的等位基因為6，在常見等位基因范圍之外，屬于稀有等位基因。另外，歐陽曙明等[14]對湖南人群D13S317、 D19S433、D21S11[15]、D3S1358、D7S820和FGA等6個基因座的OL等位基因觀察與分析，對群體遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的補充和完善。

PCR檢驗中常會由于DNA聚合酶發(fā)生滑脫，從而導(dǎo)致重復(fù)序列中核心序列重復(fù)次數(shù)的改變而出現(xiàn)突變[16]。本次檢出的OL等位基因，經(jīng)STR-PCR再擴增檢測，并經(jīng)測序獲得序列信息，結(jié)果具有可重復(fù)性，有效地避免了STR-PCR檢驗中引物結(jié)合區(qū)變異引起的等位基因丟失進(jìn)而導(dǎo)致的“假突變”現(xiàn)象，可以確定該稀有等位基因為該個體所特有，是遺傳物質(zhì)遺傳過程中染色體畸變或者基因突變的產(chǎn)物[17]。另外STR 基因座在不同群體異質(zhì)性水平較高，不同人群其等位基因和基因型頻率分布有明顯的地理差異，尤其是中國人群與美洲人群之間差異特別顯著[18-19]。

STR 遺傳標(biāo)記已經(jīng)在個體識別、親權(quán)鑒定等司法鑒定中發(fā)揮著越來越重要的作用，成為全世界法醫(yī)DNA 實驗室運用最廣泛的一類遺傳標(biāo)記[20]。

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