應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性芯片研究單親二體型來源及致病機(jī)制*

鄧　妮，　郭佩玲，　尹玉竹，　章　鈞，　田　琪，　侯紅瑛

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)科，廣東 廣州 510630)

單親二體型(uniparental disomy，UPD)是指一對同源染色體均來自一個(gè)親本,在新生兒中發(fā)生率約為0.029%，至今文獻(xiàn)已報(bào)道了約1 100例整體型UPD和120例部分型UPD[1]。據(jù)Kotzor等[2]統(tǒng)計(jì)，文獻(xiàn)報(bào)道的母源性16號(hào)染色體UPD(maternal UPD of chromosome 16,mUPD 16)約為50余例，其臨床表型多變，從無任何異常臨床表型到智力障礙、發(fā)育遲緩、結(jié)構(gòu)畸形等均見報(bào)道。mUPD 16由于已知病例均屬于涉及整條染色體的整體型單親二體型，因此16號(hào)染色體上因UPD而致病的區(qū)段及基因迄今無法定位，其致病機(jī)制也難以分析。雖然僅涉及16號(hào)染色體部分片段的部分型UPD 16病例可以幫助研究人員確定導(dǎo)致具體臨床癥狀的染色體區(qū)段，并進(jìn)一步確定致病的關(guān)鍵基因、明確基因功能和致病機(jī)制，但迄今尚無報(bào)道。我院自2012年起，應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性芯片(single nucleotide polymorphism array, SNP array)技術(shù)對124例孕婦羊水中的胎兒細(xì)胞及父母親外周血細(xì)胞進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)分析，共發(fā)現(xiàn)2例部分型mUPD 16。本研究對這2例部分型mUPD 16進(jìn)行回顧性分析，探討SNP array在單親二體型來源和致病機(jī)制研究及遺傳咨詢中的應(yīng)用價(jià)值。

材　料　和　方　法

1研究對象

我院自2012年起，對具有唐氏綜合征高風(fēng)險(xiǎn)、需行羊水胎兒細(xì)胞G 顯帶染色體核型分析的124例孕婦，在征得孕婦及丈夫的同意后，同時(shí)應(yīng)用SNP array對羊水中的胎兒細(xì)胞進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)分析，共發(fā)現(xiàn)2例部分型mUPD 16。2例孕婦經(jīng)核實(shí)孕周后，在妊娠20周前的超聲檢查中發(fā)現(xiàn)胎兒雙頂徑和股骨長均小于正常孕齡的第10位百分?jǐn)?shù)[3]，存在均稱型胎兒生長受限征象,并已排除其它可能導(dǎo)致均稱型生長受限的高危因素的存在，如TORCH綜合征、宮內(nèi)感染、抗磷脂抗體綜合征、存在狼瘡抗凝物等。妊娠22～26周三維彩超結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯的胎兒畸形，羊水細(xì)胞G顯帶核型分析顯示核型正常，見表1。

表1　2例病例的臨床資料、核型分析和SNParray結(jié)果

G1P0：gravidity time is 1 and parity time is 0; G4P0：gravidity times are 4 and parity time is 0; BPD: biparietal diameter; FL: femur length.

2方法

2.1胎兒及父母親樣本提取與處理羊膜腔穿刺術(shù)中，在超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹抽吸羊水20 mL，分別裝在2支消毒試管內(nèi)，加蓋，其中1管行羊水細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶染色體核型分析。羊水細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶核型分析按經(jīng)典方法進(jìn)行，羊水細(xì)胞分離后加入羊水培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)7 d后，分離細(xì)胞經(jīng)洗滌、低滲、固定、滴片、后固定、脫水、老化、染色后在顯微鏡下根據(jù)染色體條帶進(jìn)行判讀、分析[1]。另外1管羊水細(xì)胞懸液經(jīng)離心后獲取羊水細(xì)胞，使用QIAmp DNA Mini Kit(Qiagen)提取羊水細(xì)胞基因組DNA。另外，用肝素鈉抗凝管和EDTA抗凝管分別抽取孕婦及其配偶肘靜脈血各2 mL，分別用于胎兒父母外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶染色體核型分析和提取DNA。

2.2母血污染鑒定分別對羊水DNA標(biāo)本和母親DNA標(biāo)本進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列 (short tandem repeat, STR)擴(kuò)增(Devyser V3)并比對[4]。按說明書要求進(jìn)行結(jié)果分析，凡可能存在母源性污染的羊水沉渣樣本一律舍棄，重新分離培養(yǎng)以后的羊水細(xì)胞并提取DNA用于下一步分析。

2.3SNP array檢測和基因組拷貝數(shù)變異分析選用Illumina的HumanCytoSNP-12對羊水細(xì)胞基因組DNA和胎兒父母親外周血淋巴細(xì)胞DNA進(jìn)行拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)和雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)檢測,芯片構(gòu)成見www.illumina.com。嚴(yán)格按照產(chǎn)品操作手冊進(jìn)行全基因組擴(kuò)增、標(biāo)記、雜交、洗滌及熒光掃描,掃描結(jié)果采用Karyotyping和GenomeStudio軟件進(jìn)行分析。選取Illumina公司提供的人類基因組單倍型數(shù)據(jù)作為實(shí)驗(yàn)對照。根據(jù)原始熒光值和對照數(shù)據(jù)計(jì)算Log R Ratio值和B等位基因頻率(B allele frequency,BAF) 判斷等位基因拷貝數(shù)和基因型。Log R Ratio值低于1表示存在拷貝數(shù)缺失,大于1表示存在拷貝數(shù)重復(fù)。BAF值為0.5代表雜合型(AB),0和1分別代表純合型(AA和BB)。軟件根據(jù)連續(xù)位點(diǎn)拷貝數(shù)和基因型計(jì)算CNV的連續(xù)區(qū)段,進(jìn)行t檢驗(yàn)并給予Confidence值。分別選擇Confidence>50,片段長度>100 kb作為CNV入選標(biāo)準(zhǔn)以及Confidence>50,片段長度>5 Mbp作為LOH入選標(biāo)準(zhǔn)。篩選獲得的片段在UCSC數(shù)據(jù)庫(www.ucsc.edu)中進(jìn)行分析，并與目前國際上已有的正常人群數(shù)據(jù)庫DGV數(shù)據(jù)庫(http://projects.tcag.ca/variation)比對,通過查詢表型數(shù)據(jù)庫DECIPHER (https://decipher.sanger.ac.uk/)、PubMed數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)分析CNV和LOH的臨床意義。將CNV和LOH進(jìn)行分類:(1)多態(tài):相似的重復(fù)或缺失出現(xiàn)在3個(gè)或3個(gè)以上的正常人；(2)良性:與異常表型存在或增高的風(fēng)險(xiǎn)無關(guān),遺傳自正常的父母；(3)致病:與已知的異常表型相關(guān),或與不同外顯的異常表型相關(guān)或與異常表型增高的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；(4)未知:不確定遺傳性,或不包含已知致病基因,或不確定臨床重要性[5]。

3結(jié)果驗(yàn)證

CNV結(jié)果采用多重連接依賴性探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplication,MLPA)或real-time PCR進(jìn)行驗(yàn)證，胎兒LOH結(jié)果通過父母SNP array檢測并做連鎖分析進(jìn)行驗(yàn)證[6]。

結(jié)　　果

1孕婦1羊水中胎兒細(xì)胞的SNParray結(jié)果

用SNP芯片技術(shù)對羊水細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)分析，結(jié)果顯示為部分型UPD 16，分別位于16號(hào)染色體短臂末端和長臂末端，具體位點(diǎn)是p12.2～13.3，長度約為21.0 Mbp；16q24.1～24.3,長度約為4.1 Mbp,見表1和圖1。

Figure 1. Human genome-wide SNP array result of Case 1. FR: found region; KR: known region; DGV: Database of Genomic Variants.

圖1例1的人類全基因組SNP分型芯片檢測結(jié)果

2孕婦2羊水中胎兒細(xì)胞的SNParray結(jié)果

用SNP芯片技術(shù)對羊水細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)分析，結(jié)果顯示為部分型UPD 16,存在于16號(hào)染色體長臂末端，具體位置為16q21～24.3，大小約24.1 Mbp，見表1和圖2。

正常對照樣本的人類全基因組SNP分型芯片檢測結(jié)果見圖3。

在圖1～3中，左側(cè)方框內(nèi)藍(lán)色點(diǎn)為等位基因的BAF，位于0.5位置表示基因型為雜合子(AB)，位于兩側(cè)表示基因型為純合子(AA或BB)；左側(cè)方框內(nèi)紅色曲線為Log R值，提示等位基因的拷貝數(shù)，0表示拷貝數(shù)中性，無缺失重復(fù)，往左偏表示存在片段缺失，往右偏表示存在重復(fù)。中間柱狀圖分別為該樣本的變異區(qū)域(found region)，已知的致病的變異區(qū)域(known region)和已知的正常多態(tài)性區(qū)域(數(shù)據(jù)來自Database of Genomic Variants,DGV)。最右側(cè)G帶核型圖提示變異區(qū)段對應(yīng)的染色體位置。

Figure 2. Human genome-wide SNP array result of Case 2. FR: found region; KR: known region; DGV: Database of Genomic Variants.

圖2例2的人類全基因組SNP分型芯片檢測結(jié)果

3父母外周血細(xì)胞G顯帶染色體核型分析和SNParray結(jié)果

2例胎兒的核型分別為46,XX和46，XY,父母核型分析亦都正常。SNP array檢測并做同家系3人的基因型連鎖分析發(fā)現(xiàn)，2例胎兒的16號(hào)染色體非單親二體型部分與雙親的基因型相似度均高于99%，提示該部分染色體分別遺傳自父母雙方；而16號(hào)染色體單親二體型部分與父親基因型比較可以排除父源性遺傳可能性，而與母親基因型相似度均高于99%，證實(shí)該染色體區(qū)段存在父源性缺失，為母源性單親二體型。

討　　論

SNP array技術(shù)為本研究2例胎兒存在的均稱型生長受限闡釋了常規(guī)G顯帶染色體核型分析技術(shù)無法發(fā)現(xiàn)的細(xì)微片段的染色體改變。針對染色體疾病的診斷，學(xué)術(shù)界近年來已逐漸形成共識(shí),染色體微陣列技術(shù)包括SNP array和比較基因組雜交芯片技術(shù),應(yīng)該逐漸成為發(fā)育障礙或先天畸形個(gè)體的首選遺傳學(xué)診斷方法[6]。本研究中，除這2例mUPD 16外， SNP array檢測還發(fā)現(xiàn)了Williams綜合征、1p36微缺失綜合征、angleman綜合征、Smith-Meganes綜合征等多種已知遺傳綜合征和微缺失微重復(fù)綜合征。

Figure 3. Human genome-wide SNP array result of normal control. FR: found region; KR: known region; DGV: Database of Genomic Variants.

圖3正常對照樣本的人類全基因組SNP分型芯片檢測結(jié)果

不同類型的mUDP 16對胎兒發(fā)育的影響不盡相同[2]。單親二體型的形成與染色體不分離有關(guān)， 并通過三體補(bǔ)救、配子互補(bǔ)、單體補(bǔ)救等方式避免非整倍體的出現(xiàn)，從而形成不同類型的單親二體型存活下來[5]。SNP array除了是目前診斷單親二體型的最佳方法外[6]，可以幫助研究人員推測染色體不分離發(fā)生的不同時(shí)期并確定導(dǎo)致具體臨床癥狀的染色體區(qū)段，為進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)區(qū)域的基因序列分析、確定致病的關(guān)鍵基因及明確基因功能打下基礎(chǔ)。 (1)單親異二體型是指一對同源染色體分別來自父親或母親的2條同源染色體,其染色體不分離發(fā)生在減數(shù)分裂Ⅰ期。(2)整體型單親二體型的染色體不分離發(fā)生在減數(shù)分裂Ⅱ期，為姐妹染色單體的不分離。(3)部分型單親二體型又可分為包含著絲粒在內(nèi)和不包含著絲粒在內(nèi)2種類型。單親二體型區(qū)域包含著絲粒在內(nèi)的部分型的形成機(jī)制與整體型相類似，只是在姐妹染色單體不分離形成的二體配子與單體配子結(jié)合成三體型時(shí)發(fā)生了部分染色體的交換。本研究發(fā)現(xiàn)的2例16單親二體型均為單親二體型區(qū)域未包含著絲粒在內(nèi)的部分型。 目前，這一類型單親二體型形成的具體機(jī)制并未被完全闡明，推測可能發(fā)生在有絲分裂期。在有絲分裂過程中，同源染色體中一條染色體發(fā)生了不包含著絲粒在內(nèi)的部分缺失，其雜合性缺失由另一染色體的相對應(yīng)部分進(jìn)行復(fù)制來彌補(bǔ)[6]。這2例病例單親二體型的位置分別位于16號(hào)染色體長、短臂末端(例1)和長臂末端(例2)，兩者均在妊娠20周前出現(xiàn)了胎兒生長受限的癥狀，而例1生長受限的癥狀更為明顯。結(jié)合其它報(bào)道[2]，提示16號(hào)染色體長、短臂末端可能均存在與胎兒發(fā)育或胎盤功能相關(guān)的基因。鑒于該2例病例均未出現(xiàn)結(jié)構(gòu)畸形等癥狀，提示導(dǎo)致結(jié)構(gòu)畸形的相關(guān)基因可能位于長、短臂近著絲粒的位置。在以后的研究中，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)區(qū)域的基因序列分析來確定致病的關(guān)鍵基因及明確基因功能。

對胎兒雙親來說，顯然更關(guān)注的是單親二體型對胎兒可能造成的影響及其再次妊娠的復(fù)發(fā)幾率。從形成機(jī)制來看，單親二體型屬于新發(fā)染色體變異，即變異個(gè)體的雙親任何一方體細(xì)胞中都不存在的染色體畸變，按孟德爾遺傳規(guī)律來說，再次妊娠復(fù)發(fā)的幾率極低。而在產(chǎn)前診斷中，對新發(fā)染色體變異胎兒的預(yù)后評估往往比較復(fù)雜，更多的是依靠經(jīng)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。盡管目前文獻(xiàn)累積的部分型mUPD 16病例尚不多見，但既然已有相當(dāng)一部分mUPD 16患者出現(xiàn)胎兒生長受限和(或)胎兒畸形的報(bào)道,這2例胎兒的雙親應(yīng)該被告知不能排除胎兒生長受限進(jìn)一步加重以及胎兒和新生兒以后出現(xiàn)畸形的可能性。另外，本研究通過SNP array對胎兒雙親的外周血細(xì)胞進(jìn)行遺傳連鎖分析后發(fā)現(xiàn)，這2例UPD 16均為母源性，若母親16號(hào)染色體上相關(guān)區(qū)域存在著特定的隱性致病基因，單親二體型則意味著該基因會(huì)成為純合子，胎兒雙親應(yīng)被告知隱性疾病致病基因的暴露可能會(huì)導(dǎo)致一些罕見常染色體隱性疾病的出現(xiàn)[7]。

在本研究中，SNP array 還發(fā)現(xiàn)了相當(dāng)一部分臨床意義不明確的拷貝數(shù)變異。SNP array的分辨率高達(dá)0.7 kb[8]，而與SNP array技術(shù)的高分辨率相隨而生的正是臨床意義不明確的拷貝數(shù)變異的高檢測率[9]。隨著SNP array診斷流程逐步規(guī)范化及人們對基因組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性理解的逐步改善，人類全基因組SNP array技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。

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