MAPK通路抑制劑對(duì)三七皂苷單體R1減輕大鼠低氧高二氧化碳性肺血管收縮的影響*

馬迎春，　陳海娥,　王淑君，　黃林靜，　何金波，　應(yīng)　磊,2，　陳錫文，　王萬鐵,2△

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2缺血-再灌注損傷研究所， 3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 溫州 325035； 4赤峰上京內(nèi)分泌專科醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

以往研究證實(shí)[1-3]，絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK；如p38MAPK和ERK1/2)信號(hào)通路介導(dǎo)了大鼠低氧高二氧化碳性肺血管收縮(hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction，HHPV)及肺動(dòng)脈高壓的形成；三七總皂苷(Panaxnotoginsengsaponins，PNS)可下調(diào)p38 MAPK及ERK1/2的表達(dá)，減輕肺血管收縮，降低肺動(dòng)脈高壓。PNS水解后即生成人參二醇型皂苷Rb1、人參三醇型皂苷Rg1、三七皂苷R1等。本室先前研究表明[4-5]，三七皂苷單體R1可能是PNS發(fā)揮降低肺動(dòng)脈高壓作用的主要成分之一。但是R1對(duì)HHPV有何影響及是否通過MAPK信號(hào)通路發(fā)揮效應(yīng)，目前未見詳細(xì)報(bào)道。本研究采用不同濃度三七皂苷單體R1及MAPK通路抑制劑在急性低氧高二氧化碳條件下處理離體SD大鼠二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)，觀察血管環(huán)收縮張力的變化，探討三七皂苷單體R1對(duì)急性HHPV的影響及其與MAPK信號(hào)通路的關(guān)系。

材　料　和　方　法

1儀器設(shè)備

離體組織灌流浴槽(Panlab)；張力換能器(Panlab)；PowerLab 四道生理記錄儀(AdInstruments)；GB303型自動(dòng)電子天平(Mettler Toledo)；DSHZ-300恒溫震蕩水浴儀(江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；AVL COMPACT3型血?dú)夥治鰞x(日本希森美康醫(yī)用電子上海有限公司)；78-2型磁力攪拌器(江蘇中大儀器廠)；413型pH計(jì)(Mettler Toledo)。

2藥品和試劑

SB203580和U0126(Biosource)；二甲基亞砜(DMSO,上海申工生物技術(shù)有限公司)；重酒石酸去甲腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品)；乙酰膽堿(acetylcholine, ACh;Sigma)；三七皂苷單體R1(吉林大學(xué)天然藥物研究室)；Kreb’s液：成份(mmol/L)為NaCl 18.4，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，CaCl22.5，NaHCO325，glucose 11, EDTA 8。EDTA與KH2PO4液預(yù)先配好，其余均在當(dāng)天配好并按比例配成最終濃度。Kreb’s 液中諸試劑均為市售分析純。

3實(shí)驗(yàn)過程

3.1制作二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)Sprague-Dawley (SD)大鼠80只，體重(380±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(滬 2007-0005)。實(shí)驗(yàn)時(shí)頸椎脫臼法處死大鼠后，迅速開胸取出心肺，置于4 ℃ Kreb’s 液中迅速剪開右心室，剪除左右肺葉并洗凈殘血。然后快速、輕柔分離肺右側(cè)二級(jí)肺動(dòng)脈(注意不要過度牽拉血管和接觸血管腔面以免損傷血管內(nèi)皮)，制成 3 mm左右長的動(dòng)脈環(huán)。動(dòng)脈環(huán)穿過2個(gè)直徑 0.2 mm 的三角形不銹鋼小鉤后，置于盛有 10 mL Kreb’s 液的恒溫(37 ℃)離體血管灌注浴槽內(nèi)，下端固定于槽底部，上端通過張力換能器與 PowerLab 四道生理記錄儀相連，記錄肺動(dòng)脈環(huán)張力的變化。

3.2平衡肺動(dòng)脈環(huán)、檢測其內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)制備的二級(jí)肺動(dòng)脈的最適前負(fù)荷為750 mg，調(diào)節(jié)張力微調(diào)器使最適前負(fù)荷在60 min內(nèi)加至血管并維持平衡60 min，其間持續(xù)通入95%O2+ 5%CO2混合氣體。達(dá)到平衡后的肺動(dòng)脈環(huán)用NE(10-5mol/L)預(yù)收縮后觀察ACh(10-5mol/L)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，若出現(xiàn)95%以上的舒張反應(yīng)(舒張張力占同組NE收縮張力的百分?jǐn)?shù))視為內(nèi)皮細(xì)胞完整，否則棄之不用。最后，沖洗血管環(huán)平衡30 min，記錄平衡張力值P0。

3.3肺動(dòng)脈環(huán)常氧反應(yīng)性測定實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)向浴槽內(nèi)通入 95%O2+5%CO2混合氣體，每隔 5 min記錄1次平均張力值(P)，并計(jì)算張力變化率P%[(P-P0)/P0×100%]。

3.4肺動(dòng)脈環(huán)低氧高二氧化碳反應(yīng)性測定實(shí)驗(yàn)前用 92% N2+8% CO2的混合氣體充灌 pH=7.35的K-H液(37 ℃)約40 min，將溶液瓶密閉，用血?dú)夥治鰞x監(jiān)測 PO2及 PCO2使其分別穩(wěn)定在 30 mmHg (4.00 kPa)和60 mmHg(8.00 kPa)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將以上液體灌流入組織浴槽中形成急性低氧高二氧化碳模型。繼續(xù)向浴槽液體中通入上述無氧氣體并觀察 60 min，注意浴槽加蓋，使浴槽中的 K-H 液保持 PO2= 30～35 mmHg (4.00～4.67 kPa)，PCO2= 55～60 mmHg(7.33～8.00 kPa)。實(shí)驗(yàn)期間每隔 5 min記錄平均張力值1次，并計(jì)算低氧高二氧化碳所致的張力變化率。

3.5觀察大鼠肺動(dòng)脈環(huán)對(duì)低氧高二氧化碳的反應(yīng)及藥物干預(yù)

3.5.1篩選R1最佳濃度肺動(dòng)脈環(huán)隨機(jī)分為：(1)常氧組(N組)；(2)低氧高二氧化碳組(H組)；(3) 低氧高二氧化碳+DMSO組(HD組)；(4)低氧高二氧化碳+R1組,該組又分為低濃度(RL組)、中濃度(RM組)和高濃度(RH組)亞組。

N組在常氧條件下記錄血管環(huán)張力變化情況。其余各組按照低氧高二氧化碳反應(yīng)性測定方法測定血管張力的變化。其中HD組、RL組、RM組和RH組，分別用DMSO (0.05%)、低濃度R1(8 mg/L)、中濃度R1(40 mg/L)和高濃度R1(100 mg/L)孵育肺動(dòng)脈環(huán)20 min后，再用含上述等濃度藥物的低氧高二氧化碳浴液灌注血管環(huán)。觀察不同濃度R1對(duì)HHPV三期變化的影響，以篩選出R1緩解低氧高二氧化碳性肺血管收縮作用的最佳濃度。

3.5.2最佳濃度R1分別與SB203580及U0126聯(lián)合孵育肺動(dòng)脈血管環(huán)肺動(dòng)脈環(huán)隨機(jī)分為：(1)低氧高二氧化碳+ SB203580組(S組)；(2)低氧高二氧化碳+ U0126組(U組)；(3)低氧高二氧化碳+R1+SB203580組(RS組)；(4)低氧高二氧化碳+ R1+U0126組(RU組)。S組和U組分別用SB203580(10-5mol/L)和U0126 (10-5mol/L)孵育20 min 后按照以上相同方法測定血管張力的變化。RS組和RU組采用最佳濃度(8 mg/L)R1孵育肺動(dòng)脈環(huán)20 min 后再分別用SB203580(10-5mol/L)和U0126(10-5mol/L)繼續(xù)聯(lián)合孵育20 min，之后在急性低氧高二氧化碳條件下觀察HHPV 雙向收縮反應(yīng)的變化。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(張力變化率)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，n為肺動(dòng)脈環(huán)數(shù)，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用單因素方差分析，對(duì)每個(gè)相應(yīng)的時(shí)點(diǎn)上每個(gè)分組之間的作用做兩兩比較。方差齊性者采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s T3法檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1低氧高二氧化碳對(duì)肺動(dòng)脈環(huán)張力的影響

N組持續(xù)通入95%O2+5%CO2混合氣體60 min，P%變化不明顯。H組持續(xù)通入92%N2+8%CO2混合氣體60 min，P%呈倒拋物線樣變化；即在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中，二級(jí)肺動(dòng)脈呈現(xiàn)出雙相性收縮變化：在急性低氧高二氧化碳1～5 min內(nèi)出現(xiàn)短暫、明顯的收縮峰(I期快速收縮峰)，5～15 min出現(xiàn)較明顯的舒張(I期舒張)，15～20 min后出現(xiàn)緩慢、持久的收縮(II期持續(xù)收縮)，見圖1。

急性低氧高二氧化碳條件下，H組二級(jí)肺動(dòng)脈I期快速收縮峰最大張力變化率為(56.46±9.17)%，I期舒張最大張力變化率為(-23.87±7.62)%；II期持續(xù)收縮最大張力變化率為(62.14±8.09)%。與N組相比，急性低氧高二氧化碳引起的二級(jí)肺動(dòng)脈雙相收縮變化有顯著差異(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

2R1在低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈收縮中的作用

用不同濃度R1孵育二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)20 min 后，再用含上述等濃度單體的低氧高二氧化碳浴液灌注血管環(huán)，結(jié)果顯示，HD組和RL組HHPV的 I 期快速收縮明顯緩解，II 期持續(xù)收縮逆轉(zhuǎn)，RM組變化不明顯，RH組HHPV的 I 期快速收縮和II 期持續(xù)收縮均增強(qiáng)，與HD組比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)。提示低濃度R1對(duì)緩解低氧高二氧化碳性肺血管收縮作用最佳，見圖3。

3SB203580和U0126在R1緩解低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈收縮中的作用

用最佳濃度(8 mg/L)R1分別與SB203580及U0126聯(lián)合孵育肺動(dòng)脈血管環(huán)，結(jié)果顯示,在急性低氧高二氧化碳介質(zhì)中，RS組和RU組收縮峰值較HD組均明顯下降(P<0.05或P<0.01)，II 期持續(xù)收縮逆轉(zhuǎn)為舒張狀態(tài)。與RL組相比，RS組和RU組能顯著緩解急性低氧高二氧化碳引起的肺動(dòng)脈收縮,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與S組和U組相比，RS組和RU組能緩解急性低氧高二氧化碳引起的肺動(dòng)脈收縮,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見圖4、5。這提示MAPK通路抑制劑SB203580和U0126能加強(qiáng)低氧高二氧化碳條件下R1的血管舒張作用。

Figure 1. Dynamic changes of the secondary pulmonary artery ring tension under the hypoxia hypercapnia condition. Pulmonary arteries were exposed to acute hypoxia hypercapnia for 60 min, and a biphasic pulmonary artery contractile response (phase I acute vasoconstriction, phase I vasodilation and phase II persistent vasoconstriction) was observed.

圖1低氧高二氧化碳下二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)張力的動(dòng)態(tài)變化

Figure 2. The effect of hypoxia hypercapnia (H) on the secon-dary pulmonary artery ring tension. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsnormoxia (N) group.

圖2低氧高二氧化碳對(duì)二級(jí)肺動(dòng)脈環(huán)張力的影響

討　　論

一般認(rèn)為低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的發(fā)生分為2個(gè)階段：初期的低氧性肺血管收縮(hypoxia pulmonary vasoconstriction, HPV)和后期的肺血管結(jié)構(gòu)重建[6-7]。雖然短期的HPV 對(duì)機(jī)體是一種保護(hù)機(jī)制，但長期反復(fù)發(fā)作的HPV卻是肺動(dòng)脈高壓和肺源性心臟病的“元兇”；或者說是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和肺心病的始動(dòng)因素，在COPD和肺心病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。而長期缺氧引起的HPV、肺血管內(nèi)皮功能失調(diào)和肺血管重構(gòu)等最終會(huì)引起二氧化碳的潴留。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為：HPV發(fā)生于直徑<300 μm的阻力性肺動(dòng)脈，是單向持續(xù)性收縮反應(yīng)，即HPV發(fā)生迅速，低氧環(huán)境下1 min內(nèi)即可發(fā)生，此后數(shù)分鐘內(nèi)達(dá)到某一水平，并隨低氧的存在而維持在此收縮水平。然而，本實(shí)驗(yàn)室先前研究發(fā)現(xiàn)[8]，二級(jí)肺動(dòng)脈在急性低氧高二氧化碳條件下1 h內(nèi)呈現(xiàn)出雙相性收縮的變化，即I期快速收縮及舒張和II期持續(xù)性收縮。這一發(fā)現(xiàn)提示不同部位肺動(dòng)脈收縮反應(yīng)的機(jī)制可能并不相同。

Figure 3. Effects of low (RL), middle (RM) and high (RH) concentrations of R1 on hypoxia hypercapnia-induced pulmonary vasoconstriction. Mean±SD.n=8.▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD group.

圖3不同濃度R1在低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈收縮中的作用

Figure 4. The effect of inhibition of MAPK on the rate of changes of the pulmonary artery ring tension under hypoxia hypercapnia. Under the acute hypoxia hypercapnia condition,both p38 MAPK inhibitor SB203580(A) and ERK1/2 inhibitor U0126(B) significantly attenuated the delayed, but not early contractile phase of the biphasic pulmonary artery contraction. Mean±SD.n=8.▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD group;##P<0.01vsS group;△P<0.05,△△P<0.01vsU group.

圖4MAPK通路抑制劑對(duì)低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈環(huán)張力變化率的影響

Figure 5. The effects of SB203580 (A) and U0126 (B) on the flow-mediated vasodilation induced by the low concentration of R1. Mean±SD.n=8.▲P<0.05,▲▲P<0.01vsHD group;*P<0.05,**P<0.01vsRL group.

圖5SB203580和U0126對(duì)低濃度R1舒張血管作用的影響

我們之前的研究結(jié)果顯示[8]：p38 MAPK抑制劑SB203580及ERK1/2通路抑制劑U0126均可明顯緩解急性低氧高二氧化碳引起的二級(jí)肺動(dòng)脈II期的持續(xù)性收縮，但I(xiàn)期快速收縮(有賴于細(xì)胞外鈣離子存在)沒有變化。楊光明等[9]研究表明，p38 MAPK和ERK參與了休克血管反應(yīng)性和低氧血管平滑肌細(xì)胞收縮反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其機(jī)制與改變血管平滑肌肌球蛋白輕鏈磷酸化水平有關(guān)，可能通過鈣敏感性調(diào)節(jié)途徑來發(fā)揮作用。而p38 MAPK和ERK參與低氧高二氧化碳性肺血管收縮的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

陳重華等[10]報(bào)道，三七皂苷單體R1能顯著改善正常小鼠耳廓微循環(huán)并延長凝血時(shí)間，其機(jī)制是使細(xì)動(dòng)脈和細(xì)靜脈的血管口徑顯著增大，毛細(xì)血管開放數(shù)量明顯增多?？赡芘c其促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放一氧化氮有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室先前研究[4-5]提示，三七皂苷單體R1可抑制低氧高二氧化碳誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞ERK1/2及p38 MAPK信號(hào)通路的活化。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低濃度三七皂苷單體R1(8 mg/L)可明顯緩解HHPV的I期快速收縮，并能逆轉(zhuǎn)II 期持續(xù)收縮，表明8 mg/L三七皂苷單體R1可以明顯減輕急性低氧高二氧化碳性肺血管收縮；另外，低濃度R1+SB203580、低濃度R1+U0126聯(lián)合孵育肺動(dòng)脈血管環(huán)，發(fā)現(xiàn)HHPV的I期、II期收縮進(jìn)一步得到逆轉(zhuǎn)，提示抑制MAPK通路可能會(huì)加強(qiáng)急性低氧高二氧化碳條件下三七皂苷單體R1引起的二級(jí)肺動(dòng)脈的舒張作用，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。實(shí)驗(yàn)研究中還發(fā)現(xiàn)，低濃度、高濃度三七皂苷單體R1分別具有減輕、增強(qiáng)低氧高二氧化碳性肺血管收縮的雙向作用，提示不同濃度的三七皂苷單體R1可能抑制或激活不同的MAPK通路，進(jìn)而影響血管收縮、舒張功能。有關(guān)不同濃度R1具有減輕或增強(qiáng)急性低氧高二氧化碳性肺血管收縮的作用機(jī)制及其與MAPK通路的關(guān)系，尚待深入研究。

綜上所述，低濃度(8 mg/L)三七皂苷單體R1可減輕大鼠急性低氧高二氧化碳性肺血管收縮，其機(jī)制可能與MAPK(p38 MAPK和ERK1/2)信號(hào)通路的變化有關(guān)。

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