綠色熒光蛋白在蠶桑業(yè)的研究應(yīng)用

李迎春,林健榮

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642)

綠色熒光蛋白(green fluorescence protein；GFP)自發(fā)現(xiàn)以來備受世人矚目。對于這樣一種會自發(fā)發(fā)出熒光的蛋白分子，人們不光充滿了好奇，更是充滿了想要解開其發(fā)光機制的渴望。隨著對GFP研究的不斷深入，人們對其的認(rèn)識也愈加深入，其在科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價值和優(yōu)勢也愈加突顯?？茖W(xué)家們不斷地嘗試和研究將這一神奇的蛋白應(yīng)用在科學(xué)研究中，其對生命科學(xué)的研究發(fā)揮了不可替代的作用，催化生命科學(xué)研究的不斷深入和發(fā)展。因此，本文將著重介紹GFP近幾年在蠶桑業(yè)中的應(yīng)用及研究進展，希望其能在蠶桑業(yè)中得到更加廣泛和深入的應(yīng)用，為蠶桑業(yè)的發(fā)展帶來更多的經(jīng)濟價值。

1 綠色熒光蛋白(GFP)

1.1 GFP發(fā)現(xiàn)

GFP是由日本科學(xué)家下村修等人[1，2]在1962年從一種特殊水母(Aequorea victoria)中提取水母素時偶然發(fā)現(xiàn)的，它可以在紫外燈下自發(fā)地發(fā)出強烈的綠色熒光。美國科學(xué)家Shimomura[2]展示了GFP作為一種指示劑，跟蹤和判斷生物細胞的分子變化的功能。在此基礎(chǔ)上，錢永健[3]創(chuàng)立了發(fā)多色熒光蛋白技術(shù)，即GFP肽鏈中一些特定的氨基酸被另一種氨基酸代替后，易于得到其他發(fā)其他顏色的突變體蛋白，這滿足了體內(nèi)標(biāo)記和檢測系統(tǒng)等不同研究的需要，為生物學(xué)的發(fā)展作出了很大的貢獻。

1.2 GFP的性質(zhì)

伴隨著對GFP的不斷認(rèn)識和研究，科學(xué)家們逐漸明晰了其理化性質(zhì)、發(fā)光原理，從而為進一步研究GFP的應(yīng)用領(lǐng)域及價值打下堅實的理論基礎(chǔ)。

1.2.1 GFP的理化性質(zhì)[3，4]

GFP分子的形狀呈圓柱形，分子質(zhì)量為2.6KDa，由238個氨基酸構(gòu)成，由3個外顯子組成，分別編碼69、98 和71 個氨基酸。其中，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團，是主要的發(fā)光位置。而且，GFP 本身是一種酸性、可溶性天然熒光蛋白。它需要在氧化狀態(tài)下才能發(fā)熒光，而且只有強的還原劑能使GFP變性轉(zhuǎn)化成非熒光形式，從而使熒光消失。但是一旦重新暴露在空氣和氧氣中，GFP便立即恢復(fù)熒光。更重要的是，它們在很大的pH值范圍內(nèi)(pH值7～12. 2)的吸收、發(fā)射光譜也是相同的。

1.2.2 GFP的熒光原理

它之所以能夠發(fā)光,是因在其包含238個氨基酸的序列中,第65至67個氨基酸(絲氨酸—酪氨酸—甘氨酸)殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團。GFP與熒光素不同，一種熒光素酶只能與一種對應(yīng)的熒光素合作發(fā)光，而GFP不需要與任何物質(zhì)結(jié)合，其發(fā)光團的形成不具物種特異性，只需用藍光照射，不需要反應(yīng)底物和輔助因子，就能自發(fā)發(fā)出穩(wěn)定熒光，GFP 熒光至少能保持10min 以上，易于檢測，靈敏度高。該蛋白激發(fā)光范圍在395～475nm，發(fā)射光譜509～540nm之間[5-9]。因此，GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。

2 GFP在蠶桑業(yè)中的應(yīng)用

從GFP發(fā)現(xiàn)以來，其在生命科學(xué)中的應(yīng)用領(lǐng)域及所體現(xiàn)的應(yīng)用價值一直備受世人矚目。因為GFP具有獨特的發(fā)光原理和熒光性質(zhì)，因此其逐漸取代其他發(fā)光物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)中，發(fā)揮著不可取代的價值。在蠶桑業(yè)中亦是如此。為此，我們以GFP的指示作用這一優(yōu)勢用途，系統(tǒng)闡述其近年來在蠶桑業(yè)中的應(yīng)用及發(fā)展。

2.1 GFP在蠶業(yè)研究中的應(yīng)用

2.1.1 GFP在家蠶及繭中的表達

自從GFP被廣泛地應(yīng)用在科學(xué)研究中來，在蠶業(yè)研究發(fā)展中，很多科學(xué)家試圖將GFP在蠶體中表達，試圖將其應(yīng)用在蠶業(yè)科學(xué)研究中。Wen等[10]在蠶絲蛋白啟動子的控制下，在柞蠶原始卵母細胞中成功的表達出GFP。這說明GFP可以用于活細胞測定，通過顯微鏡直接觀察GFP的熒光，靈敏度強易于檢測，且在進一步說明其不具種屬限制。

然而，GFP是否也可以在活體中表達呢？Guo等[11]獲得重組Acserpegfp-EGT，注入5齡幼蠶的血腔內(nèi)，5 d后只有在絲腺中觀察到綠色熒光，并證實EGFP存在于彩色繭絲的水溶性部分中。王林美等[12]將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因與柞蠶核型多角體病毒轉(zhuǎn)移表達載體pApM748BE重組子，在柞蠶蛹中高效穩(wěn)定地表達了EGFP，并且EGFP在雌雄蛹間的表達水平無明顯差異。這些研究說明當(dāng)GFP的基因和我們感興趣的有機體內(nèi)所擬研究的蛋白質(zhì)基因相融合時，蛋白質(zhì)既能保持其原有的活性，GFP的發(fā)光能力也不受影響。這一系列研究表明GFP 對活細胞基本無毒害，對融合后的目的基因的結(jié)構(gòu)功能沒有影響，細胞轉(zhuǎn)化后仍可連續(xù)傳代。通過顯微鏡觀察這種發(fā)光的“標(biāo)簽”，科學(xué)家就能做到對蛋白質(zhì)的位置、運動、活性以及相互作用等一目了然。

因此，以GFP作為報告基因使實驗者直接對蠶體進行觀察篩選，為外源基因在家蠶中的表達研究提供了一種活體檢測的手段。王宇等[13]將GFP基因重組到家蠶基因中，通過檢測家蠶后代體內(nèi)熒光強度的變化，比較了解顯微注射法、精子介導(dǎo)法、脂質(zhì)體法和壓力滲透法等幾種方法的優(yōu)缺點。楊李陽[14]獲得攜帶GFP基因的基因打靶載體，通過綠色熒光在G0代家蠶中篩選轉(zhuǎn)基因蠶。這種檢測手段極大地節(jié)省了人力、物力、財力，提高了生產(chǎn)力。那么，作為一種指示蛋白，GFP是否可以用來監(jiān)視復(fù)雜多變的蛋白質(zhì)的化學(xué)進程，幫助研究蛋白質(zhì)的變化機制呢？這揭開了GFP在蛋白定位研究中的廣泛應(yīng)用。

2.1.2 GFP指示作用的應(yīng)用

綜上可以知道：GFP具有不依賴種屬的性質(zhì)；其分子量小，且是單體蛋白，易于構(gòu)建融合表達蛋白，且易于轉(zhuǎn)化；其可以自發(fā)發(fā)出穩(wěn)定熒光，不需要任何其他輔助因子，且保持時間長，易于檢測和觀察；GFP 對活細胞基本無毒害，對融合后的目的基因的結(jié)構(gòu)功能沒有影響，細胞轉(zhuǎn)化后仍可連續(xù)傳代。正因為GFP有如此得天獨厚的特點，科學(xué)家們不斷嘗試將其指示更加廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)中。

2.1.2.1 GFP定位作用

在生命科學(xué)研究中，如何將指定基因和蛋白定位在某個組織中，或者通過GFP定位目標(biāo)基因及目標(biāo)蛋白，從而可以進行進一步的研究成為了科學(xué)家們研究的熱點。GFP的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展應(yīng)用為這一難題的解決發(fā)揮了不可替代的作用。張新民[15]通過GFP熒光定位柞蠶芳香蛋白基因啟動子的區(qū)域，并通過熒光強度確定其核心區(qū)域。孟巧紅[16]構(gòu)建GFP標(biāo)記的霍亂毒素B亞基與人胰島素融合蛋白，利用GFP標(biāo)簽追蹤到此融合蛋白可與小腸粘膜發(fā)生特異性結(jié)合。由此可見，GFP是以指示的作用在指定組織中成功定位，以其熒光作為指示為蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來極大的便利。試想，如果將GFP作為一種基因標(biāo)志，那么它將會有怎樣的優(yōu)勢？

2.1.2.2 GFP的基因標(biāo)志作用

高志宏等[17]利用GFP為報告基因，研究不同截短的絲素重鏈基因啟動子在家蠶組織中的表達為沒有嚴(yán)格的組織特異性。Kato等[18]以GFP作為基因標(biāo)志從家蠶血淋巴中純化桿狀病毒粒子，并研究其作為納米粒子檢測人體腎素受體的結(jié)合狀況。這將GFP的指示作用發(fā)揮到了極致，為生命科學(xué)的研究帶來了極大的便利，從而為轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用帶來了契機。

2.1.2.3 GFP在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用

當(dāng)然，家蠶作為一種經(jīng)濟動物，通過轉(zhuǎn)基因?qū)ζ溥M行基因改造，從而獲得更多的經(jīng)濟價值成為科學(xué)家們的一個重要任務(wù)。GFP作為報告基因在轉(zhuǎn)基因蠶的研究中發(fā)揮著舉足輕重的作用。Uchino 等[19]以GFP作為報告基因，將攜帶轉(zhuǎn)座子Minos的載體注入到蠶卵中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因家蠶，首次證實在使用試管培養(yǎng)的mRNA時，Minos轉(zhuǎn)座子對于構(gòu)建載體培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因家蠶十分有效。趙越等[20]利用GFP作為報告基因成功篩選轉(zhuǎn)入人胰島素樣生長因子(hIGF-1)基因的轉(zhuǎn)基因家蠶。同年，李春峰等[21]利用GFP作為報告基因，成功獲得了在后部絲腺特異表達植酸酶融合蛋白的轉(zhuǎn)基因蠶。這為家蠶作為生物反應(yīng)器的發(fā)展和應(yīng)用奠定了堅實的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，具有極其重要的意義。

2.1.2.4 GFP在蠶體生物反應(yīng)器中的應(yīng)用

隨著生命科學(xué)的不斷深入研究，通過生物反應(yīng)器表達一些我們想要獲得蛋白等外源蛋白顯得愈加重要。而家蠶作為一種很好的生物反應(yīng)器，也深受各領(lǐng)域研究的重視。然而，如何高效表達外源重組蛋白是重要的難題。為此，構(gòu)建高效的外源表達系統(tǒng)是一重要突破。Tatematsu等[22]為了構(gòu)建一個系統(tǒng)以獲得大量重組蛋白，通過檢測GFP在家蠶絲腺中的表達量從而獲得了強效的啟動子，這對外源蛋白和生化藥物的生產(chǎn)有重要意義。同年，Zhao等[23]以EGFP作為外源基因使用新型高效表達系統(tǒng)表達系統(tǒng)選擇性在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺內(nèi)表達外源蛋白，從而證實其所構(gòu)建的表達系統(tǒng)是目前為止最為高效的外源基因表達系統(tǒng)。Ishiyama等[24]以GFP作為指示基因證實在感染桿狀病毒早期使用攜帶有 vp39啟動子和HR3的 BEVS 表達載體系統(tǒng)可有效的表達可控質(zhì)量的外源蛋白。進一步開發(fā)家蠶生物反應(yīng)器，利用轉(zhuǎn)基因蠶生產(chǎn)各種重組蛋白具有積極的促進作用。

家蠶作為生物反應(yīng)器，幼蟲蟲體是重要的“反應(yīng)箱”。Zhang等[25]以GFP作為報告基因在BmN細胞和家蠶幼蟲中表達重組蜘蛛牽引絲蛋白，并發(fā)現(xiàn)溶解度是制約高產(chǎn)表達的主要因素。Nakajima等[26]以GFP作為報告基因，使用分子伴侶輔助重組家蠶核型多角體病毒桿粒在家蠶幼蟲體內(nèi)生產(chǎn)人α-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶。

然而，絲腺作為蠶體重要器官對于合成外源重組蛋白發(fā)揮了極其重要的作用。Xue等[27]以GFP為報告基因在家蠶絲腺中成功地表達了巨噬細胞刺激因子，并在第三代中仍能高效表達，這說明外源基因可穩(wěn)定地整合到家蠶基因組中并能成功表達。同年，Li等[28]以GFP為報告基因，用BmN細胞表達人類胰島素樣生長因子(hIGF-I)。由此可見，GFP對發(fā)揮蠶體生物反應(yīng)器的功能具有極其重要的意義，對于聯(lián)通生命科學(xué)、生物醫(yī)藥學(xué)、材料學(xué)等不同領(lǐng)域?qū)W科的交叉發(fā)展和相互促進發(fā)展具有不可替代的作用。

2.1.3 增強型綠色熒光蛋白(EGFP)與多色熒光蛋白的應(yīng)用

隨著對GFP應(yīng)用的不斷深入，科學(xué)家發(fā)展了增強型綠色熒光蛋白(EGFP)，可以發(fā)出更強的綠色熒光，具有更強的知識作用。徐潔杰等[29]成功構(gòu)建了增強型綠色熒光蛋白基因真核表達載體。楊惠娟等[30]以EGFP基因為標(biāo)記基因?qū)?gòu)建好的A3啟動子缺陷piggy Bac轉(zhuǎn)座質(zhì)粒轉(zhuǎn)入家蠶中，篩選家蠶組織特異性啟動子。趙清霞等[31]成功構(gòu)建了昆蟲桿狀病毒EGFP載體，并將共轉(zhuǎn)染sf9細胞，成功表達。EGFP的使用更豐富了熒光蛋白的應(yīng)用體系。

與此同時，多色熒光體系也得到了更廣泛的應(yīng)用。Liu等[32]以橘黃色熒光蛋白(OFP)作為外源基因在蠶這樣的生物反應(yīng)器中獲得了高效表達，從而進一步獲得從蠶血淋巴提取的攜帶OFP的重組病毒并可以如儲存種子一樣儲存，用于大規(guī)模的表達。此過程省去了昂貴的細胞培養(yǎng)過程。因為OFP具有較高的熒光量子產(chǎn)率，成熟速度快，穩(wěn)定，這意味著這種蛋白質(zhì)應(yīng)該是最良好的生物技術(shù)工具用于研究可視化，監(jiān)視目標(biāo)基因的在細胞正常生長期的變化。因此，這將使人們逐漸認(rèn)識OFP的催化發(fā)光機制，及其在蠶業(yè)中的應(yīng)用。

然而，為了增加實驗的精準(zhǔn)性，科學(xué)家們不再局限于單一熒光蛋白的應(yīng)用，發(fā)展了應(yīng)用雙色熒光蛋白作為報告基因。王文兵等[33]利用GFP和RFP雙色熒光蛋白分子作為報告基因分析重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細胞和幼蟲，說明昆蟲細胞大多數(shù)只感受1次同一來源的病毒。郭學(xué)雙等[34]利用含有GFP和RFP雙式熒光基因的轉(zhuǎn)基因載體為鑒定團頭舫β-actin啟動子在家蠶BmN細胞和家蠶體內(nèi)具有活性。這些研究更突顯了熒光蛋白作為基因標(biāo)志的精確性，并預(yù)示了其在生命科學(xué)中更廣泛的應(yīng)用前景。

2.2 GFP在桑樹研究中的應(yīng)用

GFP不僅在蠶業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，近年來其在桑樹的研究中也發(fā)揮著重要的作用。王國芬[35]為研究腸桿菌在桑樹體內(nèi)的病原機制，將GFP和LuxAB 發(fā)光雙標(biāo)記基因整合到R18-2中，篩選到了發(fā)強綠色熒光的標(biāo)記菌株R18-gfp-1，并研究了GFP標(biāo)記菌在桑樹中增殖情況和感染桑樹的能力。劉嘉琦[36]以GFP作為報告基因，將重組桑低溫誘導(dǎo)蛋白基因Wap25基因?qū)胙笫[細胞表皮，發(fā)現(xiàn)綠色熒光在細胞質(zhì)中表達。同年，陸小平等[37]分析了桑樹低溫誘導(dǎo)基因Wap25的序列，利用GFP作為報告基因構(gòu)建了Wap25與GFP的重組質(zhì)粒，并在洋蔥表皮細胞中作了亞細胞定位。

綜上所述，GFP還具有酶和生物素不具有的優(yōu)勢：雖然GFP不是酶，熒光信號沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白，但是，由于GFP熒光是生物細胞的自主功能，熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的；由于其他生物本身不含有GFP，因此不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，與熒光染料相比，它能避免染料擴散造成的定位不準(zhǔn)，使結(jié)果真實可靠。這使得GFP等熒光蛋白作為報告基因具有得天獨厚優(yōu)勢，必將更加廣泛地、深入地應(yīng)用到生物科學(xué)中。

3 問題與展望

近幾年來，隨著人們對GFP的認(rèn)識的不斷加深，其在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，發(fā)揮了不可替代的作用。在蠶桑業(yè)中，GFP的應(yīng)用主要集中在蠶業(yè)領(lǐng)域的研究中，在桑樹研究中的應(yīng)用相對較少。在蠶桑業(yè)領(lǐng)域中，GFP的應(yīng)用主要集中其指示作用在細胞、組織等活體表達、組織定位、基因標(biāo)志、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、生物反應(yīng)器等方面的應(yīng)用。當(dāng)然，這些方面的研究還需要進一步深入。近年來，對于GFP的應(yīng)用主要集中在指示作用方面的基礎(chǔ)研究，對于其應(yīng)用到生產(chǎn)中還有很多的工作要做，尤其是其在家蠶作為生物反應(yīng)器這一塊的研究和應(yīng)用。家蠶作為生物反應(yīng)器的研究，融合了分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及蛋白的融合表達，而且貫通了生物醫(yī)藥、材料學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域。試想，如果通過GFP能夠?qū)⑵溥@些技術(shù)和各學(xué)科發(fā)展連貫并整合成為一個生產(chǎn)體系或者產(chǎn)業(yè)鏈，對于蠶業(yè)科學(xué)乃至生命科學(xué)將會有怎樣的意義？這將有待于進一步地研究和探索。

GFP雖有諸多得天獨厚的優(yōu)勢，但是其還是存在一些不足，即GFP不是酶，熒光信號沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白。那么，是否可以發(fā)展可以和酶類相媲美的高靈敏度的熒光蛋白呢？抑或發(fā)展出具有GFP和酶類雙重優(yōu)勢的熒光蛋白從而取代GFP呢？這為生物科學(xué)的發(fā)展帶來了更多的契機和可能。

面對科學(xué)的不斷發(fā)展和進步，有問題同樣會有期待。雖然GFP已廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)中，但是以多色熒光蛋白體系為基礎(chǔ)的雙色熒光蛋白乃至多色熒光蛋白的結(jié)合應(yīng)用仍在發(fā)展中。這一技術(shù)對于基因工程和細胞工程技術(shù)的要求更加嚴(yán)格，對于科學(xué)研究成果的可靠性提高將發(fā)揮不可估量的價值。在生命科學(xué)發(fā)展的進程中，雙色熒光蛋白技術(shù)的繼續(xù)發(fā)展和應(yīng)用一定會給我們帶來更多的應(yīng)用價值，將會為揭開生命科學(xué)之謎做出更大的貢獻。

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