甲烷單加氧酶的研究進(jìn)展

徐寧 ，辛嘉英 ,，王艷 ，董靜 ，夏春谷

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076；

2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

加氧酶是一類能高效而專一地催化分子氧摻入各種有機(jī)化合物的酶，根據(jù)加氧方式的不同，可分為單加氧酶和雙加氧酶[1]。甲烷單加氧酶（methane monooxygenase，MMO，EC.1.14.13.25，）是單加氧酶中非常重要的一種酶，可以將分子氧中的一個(gè)氧原子插入極穩(wěn)定的甲烷分子的碳?xì)滏I中，另一個(gè)氧原子則還原成水[2]。因此，對(duì)于以甲烷為惟一碳源生長(zhǎng)的甲烷氧化細(xì)菌而言，MMO在分子氧的作用下催化甲烷氧化成甲醇，而成為甲烷氧化細(xì)菌代謝過(guò)程中的重要酶系[3]。甲烷氧化細(xì)菌代謝途徑中甲烷氧化的過(guò)程可參閱文獻(xiàn)[4]。

由于上述反應(yīng)，甲烷氧化細(xì)菌能生物性轉(zhuǎn)化大氣中日益增加的溫室氣體甲烷，從而有助于緩解溫室效應(yīng)[5]。此外，甲烷氧化細(xì)菌通過(guò)MMO氧化甲烷釋放出的有機(jī)物可以作為污水脫氮過(guò)程中的電子供體，以解決城市污水處理問(wèn)題[6]。除了催化甲烷進(jìn)行單加氧反應(yīng)外，MMO還可以將氧原子插入其他烴類的碳?xì)滏I中[7]，MMO催化烯烴生成的環(huán)氧化合物是化學(xué)合成制藥工業(yè)的重要中間體，催化鹵代烴類和芳香烴類在環(huán)境污染的控制中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，如甲烷氧化細(xì)菌中的MMO可以催化三氯乙烯生成三氯乙醛，進(jìn)而被甲烷氧化細(xì)菌進(jìn)一步氧化成酸性產(chǎn)物，達(dá)到降解三氯乙烯消除環(huán)境污染的目的[8]。

MMO優(yōu)越的催化性質(zhì)使其受到了極大的關(guān)注，關(guān)于其結(jié)構(gòu)組成、催化機(jī)理、應(yīng)用前景等方面的研究也成為目前的研究熱點(diǎn)。

1 MMO的組成與結(jié)構(gòu)

MMO是一類含有雙核鐵活性中心的非血紅素蛋白酶，可從6種不同的能氧化甲烷的細(xì)菌（Methy?losinus trichosporium，Methylococcus capsulatus，Meth?ylosinus sporium，Methylocystis sp.MM1，Methylomo?nas methanica 68-1，Methylobacterium sp.CRL-26）中提取到無(wú)細(xì)胞的具有MMO活性的制劑[9]。已知MMO有2種類型：一種是分泌在周質(zhì)空間中的可溶性MMO（soluble MMO，sMMO），存在于大部分甲烷氧化細(xì)菌中；另一種是與細(xì)胞膜結(jié)合的顆粒性MMO（particulate MMO，pMMO），存在于除Methylocella以外的已發(fā)現(xiàn)的所有甲烷氧化細(xì)菌中。2種類型MMO的結(jié)構(gòu)都比較復(fù)雜，都含有多個(gè)亞基和輔助因子，但它們?cè)诖呋孜锾禺愋陨洗嬖诓町悾簆MMO的底物范圍相對(duì)較窄，只能氧化C1～C4的烴類和烯烴；相反地，sMMO催化的底物范圍更廣，包括C5～C9的烴類、烯烴、芳香族化合物和鹵代烴等。

1.1 sMMO的結(jié)構(gòu)

來(lái)源于Methylococcus capsulatus（Bath）和 Methy?losinus trichosporium OB3b的sMMO被廣泛研究。sMMO是一種含鐵的非血紅素酶，由3個(gè)組分構(gòu)成，分別是羥基化酶（MMOH）、蛋白調(diào)節(jié)酶（MMOB）和還原酶（MMOR）。MMOH是由3個(gè)亞基組成的二聚體α2β2γ2，3 個(gè)亞基的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）分別為 60×103、45×103和 20×103。每個(gè)α亞基含有一個(gè)非血紅素和一個(gè)羥基橋連接的雙核鐵中心，在這個(gè)中心甲烷和氧氣相互作用形成甲醇，這是酶的活性中心，這種晶體結(jié)構(gòu)已被證實(shí)[10]。MMOH的α亞基和β亞基間存在一條通道，該通道下面約12?處是雙核鐵中心。MMOB的Mr為16×103，其活性可由其N端的水解進(jìn)行調(diào)節(jié)，其作用是調(diào)節(jié)還原酶和羥化酶的電子傳遞過(guò)程。第3個(gè)組分MMOR的Mr是39×103，接受來(lái)自NADH2的電子，通過(guò)［2Fe-2S］和FAD輔因子，將其傳遞給MMOH的雙核鐵中心活性位點(diǎn)。

天然狀態(tài)下，MMOH中的雙核鐵中心處于氧化態(tài)，即2個(gè)三價(jià)鐵離子Fe（Ⅲ）Fe（Ⅲ），這2個(gè)Fe（Ⅲ）通過(guò)由一個(gè)羥基、一個(gè)谷氨酸和一個(gè)水分子的外源橋構(gòu)成的三重橋彼此連接，此時(shí)氧化態(tài)的MMOH沒(méi)有活性。在催化性循環(huán)中，這個(gè)雙核鐵中心首先被還原為混合態(tài)即Fe（Ⅲ）Fe（Ⅱ），開(kāi)始表現(xiàn)MMO活性，當(dāng)MMOH進(jìn)一步被還原時(shí)，雙核鐵中心就被還原為還原態(tài)的2個(gè)二價(jià)鐵離子Fe（Ⅱ）Fe（Ⅱ），二者是以μ-O連接的[11]，活性明顯增加，電子通過(guò)還原酶從NADH轉(zhuǎn)移到MMOH上。每個(gè)鐵原子都有6個(gè)配位子，1個(gè)配位了來(lái)自組氨酸的氮原子，5個(gè)配位來(lái)自谷氨酸殘基、羧基、羥基和水分子的氧原子，雙核鐵中心通過(guò)氫鍵將Thr213陷入這個(gè)酶活性腔內(nèi)。氧化狀態(tài)的雙核鐵中心可以改變它的外源性配位子的連接和形狀，這個(gè)特性對(duì)催化性循環(huán)中的sMMO而言非常重要，在催化性循環(huán)狀態(tài)下發(fā)生了羧化物轉(zhuǎn)化，氫氧化物離子平移并且打開(kāi)配位點(diǎn)與氧氣發(fā)生反應(yīng)，形成雙鐵過(guò)氧化物中間物[12]。氧化態(tài)和還原態(tài)MMOH的結(jié)構(gòu)模型已被證實(shí)[13]。

1.2 pMMO的結(jié)構(gòu)

目前，對(duì)sMMO的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的研究較多，特別是其結(jié)構(gòu)中的氧橋連接的雙核鐵中心，而對(duì)pMMO結(jié)構(gòu)模型的研究相對(duì)較少。

2005年，對(duì)從Methylococcus capsulatus（Bath）中分離到的pMMO的X線結(jié)構(gòu)的研究，標(biāo)志著pMMO結(jié)構(gòu)研究上的一次突破[14]。pMMO是由3個(gè)亞基構(gòu)成的三聚體結(jié)構(gòu)，pmoA、pmoB和pmoC等3個(gè)亞基暴露于反式膜區(qū)域上部，組成了一個(gè)α環(huán)。之前的研究沒(méi)有預(yù)測(cè)出這個(gè)三聚體結(jié)構(gòu)，通過(guò)電子顯微鏡觀測(cè)到了pMMO的形狀和容積，證明了其與三聚體結(jié)構(gòu)的生物學(xué)關(guān)聯(lián)性[15]。

在上述pMMO的晶體結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)金屬位點(diǎn)，一個(gè)金屬位點(diǎn)是單核銅離子，位于膜上25.5?處，該銅離子配位了2個(gè)組氨酸His48和His72，其中His48殘基并不保守，這個(gè)位置多為天冬酰胺殘基，而組氨酸則由谷氨酰胺替代，而His72存在于許多pmoB中，相應(yīng)的位置是精氨酸，但這個(gè)結(jié)構(gòu)并不是完全保守的。第二個(gè)金屬位點(diǎn)是鋅離子，存在于反式膜區(qū)域（鋅這個(gè)位點(diǎn)可能是偶發(fā)的，因?yàn)榻Y(jié)晶介質(zhì)需要這種金屬，在純化的pMMO中不含有鋅），該鋅離子被pmoC上的Asp156、His160和His173以及pmoA上的Glu195配位，這4個(gè)殘基堅(jiān)固。還有一個(gè)金屬位點(diǎn)是雙核銅離子簇，2個(gè)銅離子的間距為2.6?，其中一個(gè)銅離子連接了2個(gè)組氨酸（His137和His139）咪唑，另一個(gè)銅離子連接了一個(gè)咪唑以及pmoB亞基的N端[16]。

與上述從Methylococcus capsulatus（Bath）中分離的pMMO的晶體結(jié)構(gòu)不同，從Methylosinus trichospo?rium OB3b中分離到的pMMO的晶體結(jié)構(gòu)中缺少單核銅離子位點(diǎn)，而且鋅離子也被銅離子取代[17]。雙核中心通過(guò)與其他殘基結(jié)合而被牢牢固定[18]。

2 MMO的催化機(jī)理

2.1 MMO的電子轉(zhuǎn)移

甲烷氧化細(xì)菌通過(guò)sMMO催化NADH和O2配對(duì)將甲烷轉(zhuǎn)化為甲醇：

NAD（P）H+H++CH4+O2→ NAD（P）++CH3OH+H2O

在sMMO的結(jié)構(gòu)中，MMOH是活性中心，MMOB緊密地連接在α亞基的MMOH上，MMOR中的電子轉(zhuǎn)移次序是NADH→FAD→FeS→受體，在這個(gè)途徑中，被NADH還原的FAD（位于MMOR）把電子傳遞至FeS中心，這一中心再把電子直接傳遞給MMOH中的FeFe中心，但該過(guò)程中沒(méi)有底物氧化作用發(fā)生，也沒(méi)有MMOB的參與[9]。被還原的MMOH要與被氧化的底物結(jié)合，在MMOB的存在下即能實(shí)現(xiàn)氧化作用，MMOB起作用的部位尚不清楚，但其在甲烷氧化細(xì)菌氧化甲烷的過(guò)程中是必要的。

2.2 MMO的催化機(jī)理

MMOH是sMMO的活性中心，特別是其雙核鐵中心是MMO的催化活性單元。甲烷氧化細(xì)菌氧化甲烷的催化反應(yīng)中，氧化狀態(tài)的雙核鐵中心Fe（Ⅲ）Fe（Ⅲ）首先接受來(lái)自NADH的2個(gè)電子成為還原態(tài)Fe（Ⅱ）Fe（Ⅱ），然后還原態(tài)的雙核鐵中心與氧分子發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過(guò)2個(gè)中間體O和P，最終形成Fe（Ⅳ）雙核鐵簇Q，中間體Q與底物分子結(jié)合，進(jìn)一步形成中間體R和T，釋放出產(chǎn)物并重新回到MMOH的氧化狀態(tài)。O、P、Q、R、T指的是催化循環(huán)過(guò)程中不連續(xù)的中間體，這些中間體在催化循環(huán)中扮演著很重要的角色[19]。

2.3 MMO的基因表達(dá)

2.3.1 sMMO的基因結(jié)構(gòu) 目前研究較深入的是Methylococcus capsulatus（Bath）和 Methylosinus trichosporium OB3b的sMMO基因。mmoX、mmoY、mmoZ分別編碼MMOH中的α、β、γ亞基，mmoB和mmoC編碼MMOB，有趣的是，mmoB位于mmoY和mmoZ之間。ORF（指的是orfY）的功能尚未知，它的編碼容量是 12×103，位于 mmoZ 和 mmoC 之間[20]。sMMO基因簇的3個(gè)主要轉(zhuǎn)錄子為：①mmoX；②mmoY，mmoB，mmoZ；③mmoY，mmoB，mmoZ，orfY，mmoC。

2.3.2 pMMO的基因結(jié)構(gòu) 從Methylococcus capsu?latus（Bath）分離的pMMO，其基因簇按照pmoCAB排列，其中pmoB編碼45×103的α亞基，pmoA編碼26×103的β亞基，pmoC編碼23×103的γ亞基[20]。

2.3.3 MMO的基因調(diào)控 Methylococcus capsulatus（Bath）和Methylosinus trichosporium OB3b既能產(chǎn)生sMMO又能產(chǎn)生pMMO，二者的表達(dá)受銅離子濃度的調(diào)控。當(dāng)銅離子濃度低時(shí)sMMO表達(dá)，銅離子濃度高時(shí)pMMO表達(dá)而sMMO不表達(dá)。

該表達(dá)模式假設(shè)存在調(diào)節(jié)器抑制物R、活性劑和銅結(jié)合調(diào)節(jié)器CBR、pmo操縱子的σ70啟動(dòng)子。銅離子濃度高時(shí)，CBR和銅離子結(jié)合，構(gòu)形發(fā)生變化，CBA還和R、A結(jié)合在一起，這樣，阻止了R抑制pmo基因，阻止A激活smo基因，因此pMMO表達(dá)。銅離子濃度低時(shí)，CBR不能和R或A形成復(fù)合物，這樣R就能抑制smo基因的轉(zhuǎn)錄，A就能夠激活smo基因，促使連接在RNA聚合酶上的σ54開(kāi)始轉(zhuǎn)錄[20]；亦或者是結(jié)合的銅離子可能直接改變R和A的構(gòu)形，從而改變它們與操縱子的親和力。

3 MMO的活性

3.1 銅離子對(duì)MMO活性的影響

辛嘉英等[21]從Methylosinustrichosporium IMV3011的膜中分離純化出pMMO，發(fā)現(xiàn)銅離子濃度對(duì)純化的pMMO有激活作用，對(duì)苯二酚能夠作為pMMO有效的電子供體。van der Ha等發(fā)現(xiàn)[22]銅離子含量的增加對(duì)sMMO活性的增加沒(méi)有影響，當(dāng)銅離子的濃度達(dá)到0.64 mg/L時(shí)，對(duì)sMMO有抑制作用但對(duì)pMMO的活性有促進(jìn)作用。sMMO和pMMO對(duì)NaCl保持不同的活性，這可能不是二者本身的性質(zhì)導(dǎo)致的，而是由于二者位于甲烷氧化細(xì)菌中的不同位置導(dǎo)致的，pMMO嵌在細(xì)胞膜內(nèi)部，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)會(huì)緩解鹽濃度的增加，而sMMO在細(xì)胞質(zhì)中因而缺少滲透性蛋白質(zhì)的保護(hù)，但是目前沒(méi)有相關(guān)的研究報(bào)道。

3.2 其他物質(zhì)對(duì)MMO活性的影響

Yu等[23]用甲醇代替甲烷作為甲烷氧化細(xì)菌生長(zhǎng)的碳源，烯丙硫脲雖然可以抑制pMMO的活性，但Methylosinus trichosporium OB3b仍然保持生長(zhǎng)，sMMO的活性也不受影響。Miyaji等[4]的研究表明，過(guò)氧化氫酶可以增加pMMO的活性，H2O2可以作為pMMO的電子供體，產(chǎn)生的H2O2抑制了pMMO的活性。

4 結(jié)語(yǔ)

之前的30年間對(duì)MMO進(jìn)行了一系列的研究，通過(guò)對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定，在聚集體結(jié)構(gòu)、金屬中心的排列等方面取得了讓人驚喜的進(jìn)展，但還有很多方面仍然是未知的，例如MMO催化過(guò)程中的中間體P*、Q和H的結(jié)構(gòu)究竟是什么樣的、是什么構(gòu)成了Q這樣一個(gè)蛋白催化劑、為什么pMMO的結(jié)構(gòu)是三聚體、為什么這個(gè)三聚體在中心處有一個(gè)開(kāi)口等。

雖然有很多問(wèn)題有待解決，但分光鏡和高分辨率結(jié)晶學(xué)等手段的應(yīng)用和發(fā)展，以及同位素效應(yīng)實(shí)驗(yàn)、X線、量子力學(xué)的使用，為解決這些難題提供了有力的技術(shù)支持。對(duì)MMO很多方面的研究還處在初級(jí)階段，未來(lái)應(yīng)著重探討MMO蛋白合成體的結(jié)構(gòu)、pMMO催化甲烷氧化的關(guān)鍵步驟、sMMO的分子生物學(xué)特性，以及pMMO金屬中心的生物學(xué)特性及其高活性的催化機(jī)制等方面。

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