動(dòng)物可食組織中霉菌毒素的殘留及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

黃曉琳，韓劍眾*，曲道峰

(浙江工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全系，浙江 杭州 310035)

霉菌毒素是由霉菌生長(zhǎng)過程中代謝產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，主要存在于糧食(副產(chǎn)品)及飼料中，長(zhǎng)期以來，飼料霉變產(chǎn)生的霉菌毒素除嚴(yán)重影響畜禽生產(chǎn)性能外，還可造成霉菌毒素在體內(nèi)各組織器官的殘留，進(jìn)而影響動(dòng)物源性食品的安全[1]，如：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等這些對(duì)人體危害較大的霉菌毒素，國(guó)內(nèi)外采用最新檢測(cè)方法，加大檢測(cè)力度，保證食品安全。如我國(guó)出口到歐盟等市場(chǎng)的食品，必須符合進(jìn)口國(guó)有關(guān)霉菌毒素的食品安全要求，而且霉菌毒素限量也成為貿(mào)易保護(hù)的一種技術(shù)壁壘。歐盟委員會(huì)還不斷嚴(yán)格規(guī)定農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A等的限量標(biāo)準(zhǔn)。迄今為止，我國(guó)尚未制訂動(dòng)物內(nèi)臟中霉菌毒素的殘留以及相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。本文介紹國(guó)內(nèi)外有關(guān)霉菌毒素在動(dòng)物可食組織的殘留及檢測(cè)技術(shù)研究的最新進(jìn)展，可為制定動(dòng)物性食品可食組織中霉菌毒素的殘留及檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供相關(guān)依據(jù)。

1 動(dòng)物可食組織中霉菌毒素的殘留

1.1 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)是由青霉菌屬和曲霉菌屬產(chǎn)生的，具有腎毒性的霉菌毒素[2]。由于貯藏條件以及產(chǎn)品干燥技術(shù)有限，廣泛存在于谷類、豆類、花生、香料、干果和咖啡豆中[3]。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明OTA具有腎毒性、致癌、致畸和免疫毒性。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)把該毒素確定為ⅡB類致癌物。豬對(duì)OTA的毒性反應(yīng)最敏感，在感染OTA后會(huì)引起體質(zhì)量改變、厭食、頭暈和飲水排尿增加[4]。豬發(fā)生腎病往往是因?yàn)槲桂B(yǎng)的飼料被OTA污染，而使它們的腎變得腫大和蒼白，并引起血管病變。調(diào)查顯示[5]在發(fā)現(xiàn)有致命的人類腎臟疾病(巴爾干地方性腎病)爆發(fā)地方居住的人們血液中OTA的濃度很高，并且上尿路腫瘤的發(fā)病率也因此增加。

動(dòng)物飼料污染OTA后會(huì)轉(zhuǎn)移到動(dòng)物源性食品中，如豬的腎臟和血液，當(dāng)人采食了受污染的動(dòng)物源性食品會(huì)對(duì)人體造成危害。即使動(dòng)物飼料中含有低劑量OTA，動(dòng)物可食組織中依然會(huì)有OTA殘留，特別是血液和腎臟組織中[6]。OTA在胃和空腸中被吸收，不同動(dòng)物吸收OTA的程度不同，如豬可吸收66%的OTA，雞為40%，而大鼠和兔子是56%[7]。調(diào)查顯示[8]，豬采食含200ng/g OTA的飼料，腎臟組織中OTA含量可達(dá)4.6ng/g。血液中OTA含量高于其他組織，這是由于OTA能與血液白蛋白片段結(jié)合，可維持更長(zhǎng)時(shí)間。目前已有報(bào)道[9]OTA的血清半衰期具有物種差異，在人體中約35d，在豬體內(nèi)約為72～120h，而雞是4.1h。OTA在組織中的殘留量分布是腎臟＞肝臟＞肌肉＞脂肪。

聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家委員會(huì)(The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA)建議人每周OTA的最大攝入量為100ng/kg，并規(guī)定了食品中OTA的最大殘留量，如未加工谷物的殘留量為5μg/kg，而谷物制品為3μg/kg。干藤果最大殘留量為10μg/kg，嬰兒食品為0.51μg/kg。國(guó)外對(duì)豬的血液以及可食組織的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)被調(diào)查樣品中含有0.26～3.05μg/kg的OTA，一些發(fā)達(dá)國(guó)家如丹麥對(duì)豬腎中OTA的建議殘留量為10μg/kg，意大利對(duì)OTA在豬肉中的建議殘留量為1μg/kg。但是，在國(guó)內(nèi)尚未規(guī)定動(dòng)物可食組織中OTA的建議殘留量，對(duì)于OTA在動(dòng)物可食組織中的殘留報(bào)道也幾乎沒有。

1.2 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是由禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的一種具有雌激素活性的非類固醇類真菌毒素，玉米、燕麥、大麥、小麥和高粱等作物易受到ZEA的污染。由于ZEA具有擬雌激素作用和生殖發(fā)育毒性及免疫毒性[10]，可引起動(dòng)物發(fā)生雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動(dòng)物不孕或流產(chǎn)，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失[11]。ZEA也可通過被污染的谷物和肉、奶等制品進(jìn)入人體，其對(duì)人體的毒害主要為生殖發(fā)育毒性，同時(shí)對(duì)腫瘤的發(fā)生還有一定的影響，如易發(fā)生子宮癌、乳腺癌等。

動(dòng)物組織中ZEA的含量依賴于飼料的污染程度、毒素接觸時(shí)間、毒素在動(dòng)物體內(nèi)的存留時(shí)間以及動(dòng)物種類[12]。根據(jù)雌二醇受體的分配，ZEA及其代謝產(chǎn)物在子宮、乳房、肝臟和肌肉中有較高水平的表達(dá)[13]。給豬飼喂ZEA污染日糧(40mg/kg)4周，肝臟中ZEA的含量為78～128μg/kg[14]。小雞采食含ZEA 100mg/kg的日糧8d，肌肉中ZEA的含量為59～103μg/kg，肝臟中ZEA達(dá)681μg/kg[15]。ZEA及其代謝物主要在肝臟中殘留，在骨骼肌中的含量最低[16]。研究發(fā)現(xiàn)，ZEA在豬體內(nèi)主要蓄積在肝臟，在雞體內(nèi)，除肝臟外還蓄積在肌肉中，牛主要蓄積在肝臟和膽汁中。

JECFA公布了人ZEA的最大攝入量為40μg/(kg·d)。歐盟實(shí)施的EEC 253/2004法規(guī)明確細(xì)分了不包含玉米的未加工谷物、谷粉、快餐和早餐食品的ZEA最大限量為100、75μg/kg和50μg/kg，還規(guī)定了以加工谷物為主要成分的嬰幼兒食品ZEA最大限量為20μg/kg。我國(guó)2006年飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，玉米類飼料中ZEA最大含量為500μg/kg，而糧食衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定ZEA含量不超過60μg/kg。然而對(duì)于ZEA在動(dòng)物可食組織中的含量標(biāo)準(zhǔn)在我國(guó)甚至在歐盟一些發(fā)達(dá)國(guó)家都尚未作出明確規(guī)定。

1.3 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是黃曲霉和寄生曲霉的次生代謝物，依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)生衍生物的不同，分別命名為AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等。由于黃曲霉和寄生曲霉在自然界中分布廣泛，在糧食谷物的種植、收獲、運(yùn)輸及貯藏各環(huán)節(jié)中都有可能產(chǎn)生AF，從而導(dǎo)致糧食谷物及其加工產(chǎn)品中帶有該毒素。AF具有致畸、致癌、致突變作用并且對(duì)肝細(xì)胞有很強(qiáng)的毒性[17]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)早在1993年就將AF劃定為Ⅰ類致癌物。AF的廣泛污染造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，更為嚴(yán)重的是，殘留在動(dòng)物產(chǎn)品中的AF可以通過食物鏈導(dǎo)致人類患肝癌[18]。AF被動(dòng)物攝入后，迅速由胃腸道吸收，經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟，在攝食0.5～1h后，肝內(nèi)毒素濃度達(dá)到最高水平。實(shí)驗(yàn)證明，動(dòng)物攝入AFBl后，在肝、腎、血、乳汁以及雞蛋中可檢測(cè)出AFBl，其中在肝臟中殘留最多，含量可為其他器官組織的5～15倍[19]。據(jù)報(bào)道[20]，荷斯坦乳牛飼喂含AFB1飼料7d后，乳中會(huì)出現(xiàn)AFM1，但停喂4d后乳中的AFM1消失。

世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的食品中AFB1最高允許含量為15μg/kg，我國(guó)的食品中AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)為5～20μg/kg，而對(duì)新鮮豬組織中AF的殘留量規(guī)定不得超過0.5μg/kg，歐盟則不得超過0.05μg/kg。盡管國(guó)內(nèi)外有規(guī)定但對(duì)動(dòng)物可食組織中AFB1的殘留檢測(cè)報(bào)道極少。

1.4 T-2毒素

T-2毒素是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物中毒性較強(qiáng)的一種毒素。該毒素已在全球范圍內(nèi)廣泛出現(xiàn)，在我國(guó)谷物中的檢出率為80%[21]。玉米、小麥、大麥、燕麥和黑麥?zhǔn)鞘躎-2毒素污染最為嚴(yán)重的作物品種。T-2毒素的毒性較強(qiáng)，人畜誤食被污染的谷物或飼料會(huì)引發(fā)多種急慢性中毒[22]。通常人畜T-2毒素中毒是通過食用被污染的谷物或飼料而低劑量長(zhǎng)期暴露導(dǎo)致，另外，動(dòng)物食用受污染的飼料會(huì)造成動(dòng)物源性食品中的毒素殘留，也間接威脅著人類健康[23]。

對(duì)于大多數(shù)動(dòng)物，通過進(jìn)食途徑攝入的T-2毒素進(jìn)入消化道后能被機(jī)體迅速吸收、代謝并排出體外，不同物種的吸收率在10%～50%之間。T-2毒素在腸道中48h內(nèi)會(huì)很快被吸收降解，代謝掉80%～90%，但它的毒性可能通過肝膽再循環(huán)而增加[24]。研究發(fā)現(xiàn)[25]，在可食組織中T-2毒素的蓄積濃度不是很高。

WHO規(guī)定T-2毒素的人日耐受量為60ng/kg。迄今為止由于監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)缺乏，國(guó)內(nèi)至今未形成健全的T-2毒素安全性評(píng)估方案，目前僅限定所有動(dòng)物全價(jià)配合飼料中T-2毒素的限量值為0.08mg/kg。

2 動(dòng)物可食組織中霉菌毒素的殘留檢測(cè)

盡管對(duì)糧食和飼料中霉菌毒素的檢測(cè)已有許多方法，如薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法等[26]，但對(duì)動(dòng)物組織中霉菌毒素的檢測(cè)分析則主要是通過儀器進(jìn)行，其分析過程一般包括樣品的前處理及毒素的定量檢測(cè)。

2.1 樣品的前處理

動(dòng)物組織中霉菌毒素的提取一般用氯化劑酸化除去蛋白質(zhì)，通常使用乙腈、氯仿作為提取溶劑，但它們的毒性較大，對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)操作人員的危害較嚴(yán)重，因此多采用甲醇或復(fù)合提取溶劑，如乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙腈等。

2.1.1 液-液萃取凈化法(1iquid-liquid partition，LLP)

液-液萃取法最早被用于樣品預(yù)處理，它的基本原理是分配定律，即在一定溫度條件下，溶質(zhì)在兩種不相溶的溶劑分配時(shí)，平衡濃度之比為一常數(shù)。這一方法可把易溶于有機(jī)試劑的化合物直接萃取到與水不相溶的有機(jī)試劑中。

液-液萃取法優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，使用的儀器、試劑便宜，一般實(shí)驗(yàn)室都能完成。但該方法勞動(dòng)強(qiáng)度大，程序不能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且需使用大量的有機(jī)溶劑，易造成環(huán)境污染和毒素流失，毒素回收率不高。Monaci等[27]使用LLP凈化豬腎、肌肉中的OTA，加標(biāo)含量為1μg/kg時(shí)，回收率分別為(86±15)%和(74±8)%，檢出限分別為0.14、0.15μg/kg。

2.1.2 固相萃取柱凈化法(solid-phase extraction，SPE)

固相萃取柱通常用于樣品分析前凈化。固相萃取一般有4個(gè)基本步驟：固定相活化、樣品上柱、淋洗和分析物洗脫。其一般步驟是：液態(tài)或溶解后的固態(tài)樣品倒入活化過的固相萃取柱，然后利用抽真空或加壓使樣品進(jìn)入固定相。一般情況下，固相萃取步驟中將需要的組分先保留，不需要的組分先用一種溶劑沖洗掉，然后用另一溶劑把需要的分析物從固定相上洗脫下來。

固相萃取柱凈化法優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便，使用的有機(jī)試劑較少，對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員的危害較小，但由于它對(duì)樣品中毒素的作用力為非特異性吸附力，因此對(duì)毒素的凈化純度和回收率不可能同時(shí)達(dá)到很高。Zollner等[28]使用Oasis HLB柱固相萃取凈化豬肝臟的ZEA，檢測(cè)限和定量限分別為0.1、0.5μg/kg，回收率為85%。Jodlbauer等[29]使用RP-18 柱固相萃取凈化豬肉中的ZEA，檢測(cè)限和定量限分別為0.5、1.0μg/kg，回收率為86%。

2.1.3 免疫親和柱凈化法(immunoaffinity columns，IAC)

免疫親和柱是近幾年來免疫技術(shù)應(yīng)用于食品中霉菌毒素提取凈化的一種常用技術(shù)。它的原理是利用免疫反應(yīng)的高度特異性，使所需凈化的毒素固定在免疫親和柱上，不需保留的組分先用一種溶劑沖洗掉，毒素再經(jīng)另一種洗脫液洗脫，從而使樣品中的毒素得以凈化。

單克隆抗體免疫親和柱凈化法的優(yōu)點(diǎn)是具有高度的特異性，能去除基質(zhì)中絕大部分的雜質(zhì)，對(duì)毒素凈化的效果較好，回收率高。Gathumbi等[30]使用IAC凈化雞肝臟中的AFB1，加標(biāo)含量1～5μg/kg時(shí)的回收率為54.3%～65.5%，檢測(cè)限為(15±0.77)pg/mL。

2.2 檢測(cè)方法

動(dòng)物組織中霉菌毒素的檢測(cè)方法主要采用高效薄層色譜法(high-performance thin-layer chromatography，HPTLC)、高效液相色譜熒光檢測(cè)法(high-performance liquid chromatography-fluorescence detection，HPLCFLD)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-mass spectrum/mass spectrum，LC-MS/MS)。

2.2.1 薄層色譜分析

薄層色譜分析是較早用于毒素檢測(cè)的一種方法，其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，使用的試劑價(jià)格便宜，但是該方法靈敏度相對(duì)較差，所需試劑繁多、檢測(cè)周期長(zhǎng)、無法自動(dòng)化等，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測(cè)要求。Mili?evi?等[31]建立HPTLC方法檢測(cè)豬腎臟及肝臟中OTA的殘留量，檢測(cè)限和定量限分別為0.5、1.0μg/kg，回收率為83%。

2.2.2 高效液相色譜

高效液相色譜是目前最常用于食品中毒素檢測(cè)的方法，它的優(yōu)點(diǎn)是可進(jìn)行定性和定量分析，并可配套使用不同的萃取、提純及柱前、柱后衍生和靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高、重現(xiàn)性好，得到越來越廣泛的應(yīng)用。但由于其設(shè)備昂貴、對(duì)樣品中毒素純度的要求較高，導(dǎo)致檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)，無法滿足大批量樣本快速篩查的需要，因而使用受到限制。Losito等[32]建立了檢測(cè)豬肉組織中OTA的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法，檢測(cè)限為0.61μg/kg。

史瑩華等[33]建立HPLC方法測(cè)定動(dòng)物組織中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量。用反相HPLC分離，柱后光化學(xué)衍生，熒光檢測(cè)器測(cè)定AF含量，保留時(shí)間定性，峰面積定量，測(cè)定了樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣。對(duì)動(dòng)物肝臟和肌肉進(jìn)行10、20μg/kg兩個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，4種黃曲霉毒素的平均回收率為68.71%～83.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.51%～7.40%，檢出限均達(dá)到2.65pg。

de Saeger等[34]采用LC-MS-MS方法測(cè)定腎臟中OTA含量。以赭曲霉毒素B(ochratoxin B，OTB)為內(nèi)標(biāo)，質(zhì)譜采用電噴霧離子化(electrospray ionization，ESI)方式和多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式進(jìn)行正離子檢測(cè)。檢測(cè)限和定量限分別是0.11、0.25μg/kg。加標(biāo)0.5、1、2.5μg/kg OTA時(shí)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性分別為為9%、9%、5%。加標(biāo)0.25、0.5、1μg/kg OTA時(shí)回收率分別為75%、69%和57%。

Jodlbauer等[35]建立LC-MS/MS測(cè)定牛、豬組織中ZEA的方法。樣品經(jīng)酶水解、RP-18柱固相萃取凈化后用質(zhì)譜測(cè)定，采用大氣壓化學(xué)電離(atmospheric pressure chemical ionisation，APCI)方式和MRM進(jìn)行負(fù)離子檢測(cè)，豬和牛的檢測(cè)限分別為0.1、0.5μg/kg，定量限分別為0.5、1μg/kg。加標(biāo)樣品的回收率在86%～102%。

3 結(jié) 語

飼料中霉菌毒素的污染十分普遍，其對(duì)畜禽的危害也已引起人們的高度重視。霉菌毒素能在動(dòng)物可食組織中蓄積，但對(duì)動(dòng)物性食品特別是可食組織中的霉菌毒素的殘留及檢測(cè)等研究則十分滯后。隨著人們對(duì)霉菌毒素殘留危害的認(rèn)識(shí)，有理由相信，動(dòng)物性食品特別是可食組織中霉菌毒素殘留及相關(guān)檢測(cè)研究必將得到長(zhǎng)足的發(fā)展。

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