微衛(wèi)星在釀酒酵母研究中的應(yīng)用

馮 敏，劉延琳*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

微衛(wèi)星DNA由短的核心序列(一般1～6bp)串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成，故也被稱(chēng)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats, SSRs)，如(CA)n、(GTG)n等，其中雙核苷酸重復(fù)最為常見(jiàn)，其次為3個(gè)核苷酸或者4個(gè)核苷酸的重復(fù)。微衛(wèi)星在真核生物基因組中廣泛存在且均勻分布，在酵母中，每100kb就有1.8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)[1-2]。自釀酒酵母全基因組序列公布以后，科學(xué)家開(kāi)始構(gòu)建搜索釀酒酵母微衛(wèi)星序列的方法，并取得顯著成果[2-5]。因微衛(wèi)星在真核生物基因組中種類(lèi)多、分布廣，呈選擇中性和共顯性遺傳，多態(tài)性豐富且在種內(nèi)高度保守，一些學(xué)者已將微衛(wèi)星位點(diǎn)的組合分析用于釀酒酵母分型和遺傳多樣性研究，但尚未達(dá)到該技術(shù)的最大分辨率[6-9]。鑒于此，Legras等[10-11]對(duì)41個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息進(jìn)行評(píng)估和篩選，得到6個(gè)穩(wěn)定的高變異微衛(wèi)星位點(diǎn)，而這6個(gè)位點(diǎn)豐富的多態(tài)性也在隨后其他學(xué)者的研究中得到認(rèn)可。近年來(lái)，隨著微衛(wèi)星序列搜索技術(shù)、引物開(kāi)發(fā)技術(shù)和檢測(cè)分析技術(shù)的不斷完善，其在釀酒酵母相關(guān)研究中得到了更為廣泛的應(yīng)用，并呈現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景。

1 微衛(wèi)星的應(yīng)用原理

1.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性形成機(jī)理

微衛(wèi)星DNA因其核心序列重復(fù)次數(shù)不同及重復(fù)程度不同形成了每個(gè)座位的多態(tài)性[12]，而重復(fù)次數(shù)的差異是DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中滑動(dòng)錯(cuò)配或減數(shù)分裂過(guò)程中非姐妹染色單體的不等交換所致[13-14]。而微衛(wèi)星的進(jìn)化則是通過(guò)鏈滑移而非重組[15]。此外，Messier等[16]認(rèn)為微衛(wèi)星序列越長(zhǎng)，其多態(tài)性也越豐富，其原因是在DNA復(fù)制或者修復(fù)時(shí)，滑動(dòng)鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配，如果錯(cuò)配不能修復(fù)，將會(huì)導(dǎo)致一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位的插入或缺失。而微衛(wèi)星越長(zhǎng)，產(chǎn)生錯(cuò)配的機(jī)會(huì)越大，微衛(wèi)星多態(tài)性也越豐富。

1.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)分析方法

1.2.1 分析原理

微衛(wèi)星核心序列兩側(cè)的側(cè)翼序列在種內(nèi)高度保守，這是設(shè)計(jì)適當(dāng)引物擴(kuò)增微衛(wèi)星核心序列的基礎(chǔ)?；趥?cè)翼序列在種內(nèi)高度的特異性和核心序列因重復(fù)次數(shù)差異產(chǎn)生的多態(tài)性，可使用某微衛(wèi)星位點(diǎn)的特異引物，以不同個(gè)體的基因組DNA為模板，對(duì)該位點(diǎn)的核心序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若同源染色體某個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的核心序列重復(fù)數(shù)目相同，則該個(gè)體在這個(gè)位點(diǎn)是純合的，否則便是雜合的。

1.2.2 分析方法

微衛(wèi)星PCR結(jié)果經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，毛細(xì)管電泳檢測(cè)或者測(cè)序后，通過(guò)POPGENE1.32，Microsatellite_tool kit，GENEPOP1.2等軟件對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)、基因雜合度(heterozygosity，H)和多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)是衡量群體微衛(wèi)星變異程度的指標(biāo))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[17-19]。利用AMOVA、NTSYSpc 2.0、PHYLIP3.6等分析釀酒酵母菌株親緣關(guān)系、釀酒酵母群體的遺傳關(guān)系等[20-22]。

1.2.3 釀酒酵母研究中常用微衛(wèi)星位點(diǎn)信息

常用微衛(wèi)星位點(diǎn)信息見(jiàn)表1。

2 微衛(wèi)星在釀酒酵母分類(lèi)鑒定中的應(yīng)用

2.1 微衛(wèi)星用于鑒定釀酒酵母

Schuller等[28]分別用6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR、interdelta序列分析和線(xiàn)粒體DNA HinfⅠ酶切3種方法考察23株商業(yè)酵母，每種方法均得到21種基因型，Schuller指出這3種方法均可作為鑒定釀酒酵母的常規(guī)方法在釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用。Vaudano等[29]利用3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多重PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)30株釀酒酵母商業(yè)菌株進(jìn)行區(qū)分，其中除DSM Fermivin和Laffort Zymaflore ST兩株菌之外，其余28株菌表現(xiàn)出明顯的帶型差異。此外，他還對(duì)所選微衛(wèi)星標(biāo)記的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)方法的可重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，指出微衛(wèi)星標(biāo)記穩(wěn)定性好，靈敏度高，可用于檢測(cè)工業(yè)發(fā)酵中野生酵母的污染。Howell等[26]通過(guò)微衛(wèi)星位點(diǎn)SC8132X對(duì)6個(gè)釀酒酵母群體進(jìn)行分型，得到4個(gè)多態(tài)類(lèi)群，從中選擇3種不同分型的菌株混合發(fā)酵，利用微衛(wèi)星PCR對(duì)發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母種群進(jìn)行監(jiān)控，指出發(fā)酵是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，發(fā)酵始末釀酒酵母群體結(jié)構(gòu)存在差異。Pérez等[9]從10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中選出6個(gè)高多態(tài)性位點(diǎn)，對(duì)來(lái)自不同酒廠(chǎng)的51株釀酒酵母進(jìn)行區(qū)分，得到57個(gè)等位基因和44個(gè)基因型。Pérez指出多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)組合分析具有很高的分辨率。González Techera等[23]曾對(duì)烏拉圭的6株本土釀酒酵母和3株商業(yè)釀酒酵母進(jìn)行區(qū)分，通過(guò)3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增和多態(tài)性分析，成功區(qū)分上述9個(gè)菌株。他認(rèn)為由于微衛(wèi)星分型結(jié)果可轉(zhuǎn)換為數(shù)量數(shù)據(jù)，故比其他分型技術(shù)具有更大的優(yōu)越性，并提議可將該方法作為鑒定釀酒酵母的常規(guī)方法。

2.2 微衛(wèi)星用于構(gòu)建釀酒酵母菌株分型數(shù)據(jù)庫(kù)

Jubany等[24]曾提出基于微衛(wèi)星位點(diǎn)和SNPs對(duì)釀酒酵母菌株進(jìn)行分型的標(biāo)準(zhǔn)方法，他們利用從33個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出的9個(gè)高多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)120個(gè)菌株進(jìn)行分析，并結(jié)合FLO8的SNPs分析，初步構(gòu)建釀酒酵母菌株微衛(wèi)星和SNPs分型數(shù)據(jù)庫(kù)(www.pasteur.edu.uy/yeast)，旨在收集和規(guī)范來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)。Jubany選擇S288C和AB972作為參考菌株，供試菌株某位點(diǎn)的分析結(jié)果以其與參考菌株該位點(diǎn)的重復(fù)數(shù)差異來(lái)表示，比如，+4表示供試菌株比參考菌株在該位點(diǎn)多4個(gè)重復(fù)，而－7則表示比參考菌株少7個(gè)重復(fù)。這種用重復(fù)數(shù)差異來(lái)表示等位基因的方法，第一次使得不同實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的交換和共享成為可能。隨后Richards等[25]基于10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)和MAT位點(diǎn)構(gòu)建了另一個(gè)釀酒酵母分型數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含246個(gè)菌株：78株葡萄酒商業(yè)酵母、103株世界各地的野生酵母、34株由 Saccharomyces genome resequencing project(SGRP)測(cè)序的野生酵母、31株新西蘭酒廠(chǎng)分離的酵母。故可直接比較這34個(gè)菌株DNA序列數(shù)據(jù)與微衛(wèi)星基因型之間的關(guān)系。該研究首次提出建立菌株DNA序列與微衛(wèi)星基因型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

表 1 常用微衛(wèi)星位點(diǎn)信息Table 1 Characteristics and primers of hypervariable SSR loci in Saccharomyces cerevisiae

3 微衛(wèi)星在釀酒酵母菌株倍性確定中的應(yīng)用

Ezov等[30]從以色列和美國(guó)卡梅爾的“進(jìn)化峽谷”分離得到68個(gè)野生釀酒酵母單菌落，利用19對(duì)微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)目和雜合度進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)所選19個(gè)位點(diǎn)都具有較高的等位基因多態(tài)性，平均每株菌每個(gè)位點(diǎn)有5.1個(gè)等位基因。Ezov認(rèn)為如果一個(gè)菌株每個(gè)位點(diǎn)有1～4個(gè)等位基因，這便預(yù)示著該菌株可能為多倍體，他預(yù)測(cè)68株釀酒酵母中包含有二倍體、三倍體，甚至還有四倍體。之后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析(flow cytometry analysis，F(xiàn)ACS)，Ezov的預(yù)測(cè)得到確認(rèn)，分別有21個(gè)二倍體菌株，7個(gè)三倍體和40個(gè)四倍體。Muller等[31]選擇12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)170株臨床和非臨床釀酒酵母菌株進(jìn)行分析，得到161種基因型，每個(gè)位點(diǎn)有16～42個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)有27個(gè)等位基因。而每株菌每個(gè)位點(diǎn)都有1～4個(gè)等位基因，暗示這些菌株存在倍性差異。Muller預(yù)測(cè)55%的菌株是二倍體，14%為三倍體，11%為四倍體。最后，臨床菌株雜合子的比例高于非臨床菌株，暗示在臨床環(huán)境中雜合子菌株的選擇性?xún)?yōu)勢(shì)。

4 微衛(wèi)星在釀酒酵母親緣關(guān)系確定方面的應(yīng)用

Mercado等[32]連續(xù)兩年從ZARM產(chǎn)區(qū)的酒廠(chǎng)設(shè)備和馬爾貝克葡萄汁的自然發(fā)酵過(guò)程中采樣，從所分離釀酒酵母中選擇出28個(gè)代表菌株，連同來(lái)自法國(guó)的7株商業(yè)酵母，通過(guò)interdelta分型、mtDNA限制分析和微衛(wèi)星PCR 3種方法考察它們之間的親緣關(guān)系。3種方法結(jié)合分析，可準(zhǔn)確區(qū)分34株釀酒酵母。研究結(jié)果顯示，一些菌株其來(lái)源雖相同，但分子關(guān)系復(fù)雜，系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)也會(huì)隨分析方法的不同存在差異；同時(shí)，根據(jù)不同的研究目的選擇不同分析方法的重要性和必要性。Malgoire等[33]對(duì)來(lái)自法國(guó)醫(yī)學(xué)中心的69株釀酒酵母和8個(gè)參考菌株(5株釀酒酵母，3株布拉酵母)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，共選擇5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，得到34個(gè)等位基因，64種電泳類(lèi)型，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行因子對(duì)應(yīng)分析，結(jié)果聚為3類(lèi)，類(lèi)群Ⅰ只包含臨床菌株，類(lèi)群Ⅱ包含釀酒酵母參考菌株，類(lèi)群Ⅲ則由布拉酵母參考菌株構(gòu)成。他評(píng)價(jià)微衛(wèi)星可揭示臨床釀酒酵母菌株高度多樣性，是研究酵母親菌株緣關(guān)系的有力工具。

5 微衛(wèi)星在釀酒酵母群體研究中的應(yīng)用

Schuller等[27]在2001—2003年間從葡萄牙3個(gè)葡萄園分離得到1260個(gè)釀酒酵母單菌落，經(jīng)過(guò)mtDNA-RFLP初步分型，得到361個(gè)不同類(lèi)群，隨后對(duì)其6個(gè)高多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行分析，共得到93個(gè)等位基因，其中52個(gè)首次被報(bào)道。假設(shè)所選位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，經(jīng)計(jì)算，6個(gè)位點(diǎn)雜合度觀測(cè)值(observed heterozygosity，Ho)均低于期望值(expected heterozygosity，He)3～4倍，暗示供試群體的無(wú)性繁殖及子結(jié)構(gòu)化。此外，3個(gè)葡萄園釀酒酵母群體間的遺傳差異表現(xiàn)為等位基因頻率的不同。該研究第一次使用微衛(wèi)星分型技術(shù)對(duì)大量本土釀酒酵母菌株進(jìn)行生態(tài)研究，為釀酒酵母菌株生態(tài)學(xué)和生物地理學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，也為生物多樣性和遺傳資源的保護(hù)提供依據(jù)。Pereira等[34]曾累計(jì)4a(2001—2003年， 2006年)從5個(gè)產(chǎn)區(qū)(Estremadura、Palmela、 Alentejo、Vinho Verde、Bairrada)20個(gè)葡萄園和9個(gè)葡萄品種分離得到4470個(gè)釀酒酵母菌株單菌落。通過(guò)mtDNA-RFLP和interdelta-PCR結(jié)合分析后得到502個(gè)類(lèi)群，從每個(gè)類(lèi)群各選擇一株釀酒酵母作為代表菌株，進(jìn)行10個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星PCR，得到192個(gè)等位基因，計(jì)算亞群間(這里指來(lái)自不同產(chǎn)區(qū)的類(lèi)群)的遺傳分化程度指標(biāo)(Fst)和等位基因頻率相似矩陣，并基于此構(gòu)建不同亞群的系統(tǒng)樹(shù)。結(jié)果顯示，釀酒酵母群體的遺傳差異主要來(lái)自特定葡萄園特異等位基因的差異及10個(gè)位點(diǎn)等位基因頻率微小差異的積累，這些差異可用于鑒定群體結(jié)構(gòu)；4個(gè)年份中，同一個(gè)葡萄園均分離出相同或類(lèi)似的釀酒酵母菌株，暗示每個(gè)葡萄園都有其不同于其他葡萄園的酵母群體，且特異性本土酵母的出現(xiàn)可能與風(fēng)土有關(guān)。

工業(yè)生產(chǎn)中形形色色的發(fā)酵產(chǎn)品背后隱藏著釀酒酵母菌株迷人的遺傳多樣性，保護(hù)酵母多樣性的核心內(nèi)容就是保護(hù)酵母的遺傳多樣性。微衛(wèi)星技術(shù)可揭示菌株地理起源和遺傳特征之間的關(guān)系、兩兩菌株之間的關(guān)系及釀酒酵母群體之間的關(guān)系，是分析釀酒酵母多樣性的有力工具。隨著微衛(wèi)星序列搜索技術(shù)、引物開(kāi)發(fā)技術(shù)和檢測(cè)分析技術(shù)的不斷完善，微衛(wèi)星標(biāo)記將會(huì)在釀酒酵母研究中表現(xiàn)出更強(qiáng)的生命力，為本土釀酒酵母菌株遺傳多樣性的保護(hù)和開(kāi)發(fā)提供更大便利，為釀酒酵母群體生態(tài)學(xué)研究開(kāi)拓更多視角。

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