卵黃高磷蛋白乳化性的研究進展

陳海英，張慧娟，金亞美，段翔，楊哪，徐學(xué)明，3

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京，1000480)3(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

卵黃高磷蛋白(phosvitin，簡稱PV)是一種高度磷酸化的糖蛋白，主要存在于魚卵和禽蛋的蛋黃部分［1］。它包含220種氨基酸殘基，其中一半是磷酸酰絲氨酸，其余的氨基酸殘基則由酸性氨基酸組成［2］。卵黃高磷蛋白是由α-卵黃高磷蛋白和β-卵黃高磷蛋白構(gòu)成，其中α-卵黃高磷蛋白主要成分的亞基單位分子質(zhì)量分別為 37 500，42 000 和45 000 Da，β-卵黃高磷蛋白主要成分的分子質(zhì)量為45 000 Da［3］。卵黃高磷蛋白的結(jié)構(gòu)與酪蛋白相似，含有蛋白質(zhì)單體，在溶液中以線性、無序狀態(tài)存在。在中性pH條件下，這些蛋白質(zhì)單體攜帶大量的負電荷，并且含有磷酸酰絲氨酸簇殘基 (αs1-酪蛋白中有8個，β-酪蛋白中有5個)［4］。酪蛋白因其良好的雙極性及在油水界面呈現(xiàn)松散的界面結(jié)構(gòu)而表現(xiàn)出優(yōu)秀的乳化特性［4-7］。

目前，國內(nèi)外對卵黃高磷蛋白及其制品的研究已有大量的報道，主要集中在卵黃高磷蛋白及其多肽本身性質(zhì)的鑒定，提取分離工藝的優(yōu)化與改革，以及針對卵黃高磷蛋白特殊特性如抗氧化性、抑菌性、金屬離子螯合作用、乳化性等在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。其中，卵黃高磷蛋白優(yōu)異的乳化特性更是近期研究的熱點問題。卵黃高磷蛋白的乳化性由很多因素共同決定，本文從雞蛋卵黃高磷蛋白自身組成及結(jié)構(gòu)、乳化作用環(huán)境、蛋白改性和蛋白與其他添加劑協(xié)同作用等方面分別闡述了對卵黃高磷蛋白乳化性的影響。

1 卵黃高磷蛋白本身性質(zhì)對乳化性的影響

卵黃高磷蛋白中磷酸根基團之間的靜電排斥力對蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性起到了關(guān)鍵性作用。卵黃高磷蛋白中絲氨酸的磷酸?；瘜?dǎo)致該蛋白在自然情況下帶有大量的負電荷，電壓約為-179mV。Kato等人［8］發(fā)現(xiàn)，如果使用磷酸酶去除部分磷酸根基團，或者通過堿法去除全部磷酸根基團，卵黃高磷蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性都急劇下降。此外，通過加入鈣離子與磷酸根基團結(jié)合也會降低卵黃高磷蛋白的乳化特性。實踐證實，帶有大量的磷酸根是卵黃高磷蛋白具有乳化活性，尤其是乳化穩(wěn)定性比血清蛋白要高的關(guān)鍵原因。

卵黃高磷蛋白特殊的氨基酸組成及組成結(jié)構(gòu)更是其具有高乳化性的核心因素。卵黃高磷蛋白含有大量的絲氨酸殘基，并且這些絲氨酸基本全部被磷酸基?；?，在蛋白的中心形成單一細長的親水性核心。同時，卵黃高磷蛋白的C端含有15個富含疏水性氨基酸的氨基酸末端，這個微小的疏水性末端尾巴對油液滴有較強的固定作用，而中心強大的親水性核心則保證了蛋白在水溶液中的充分溶解［9］。Timasheff等人［10］通過圓二色譜圖譜(185 ～320 μm)證實了卵黃高磷蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要是松散的無序狀態(tài)。這種松散的無序結(jié)構(gòu)，使得蛋白較球形蛋白或者結(jié)構(gòu)緊密的蛋白而言，更容易吸附在油液滴的表面，進而更容易形成穩(wěn)定的乳化體系。當(dāng)卵黃高磷蛋白作為乳化劑使用在油水體系中時，蛋白可以吸附到油液滴的表面，降低油水界面的界面張力，同時在界面形成一層薄膜來形成穩(wěn)定的膠質(zhì)體系［11］。然而，卵黃高磷蛋白的界面特性比酪蛋白差。即使在較高濃度(如0.1 mg/mL)下，卵黃高磷蛋白在油水界面也表現(xiàn)出較慢的吸附動力學(xué)特性來降低界面張力。這主要是因為卵黃高磷蛋白會通過磷酸鈣的架橋作用形成聚集。

2 外界環(huán)境對卵黃高磷蛋白乳化性的影響

卵黃高磷蛋白形成的油水乳化體系特性受蛋白濃度、油添加體積分數(shù)、攪拌速度及攪拌時間等顯著影響。隨著蛋白濃度、油體積分數(shù)以及攪拌速度的增加，卵黃高磷蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性就有所增加。其中攪拌速度對其乳化活性的影響最大，而蛋白濃度的影響最小。對乳化穩(wěn)定性來講，攪拌速度的影響最為強烈［12］。

乳化體系pH值及NaCl濃度影響蛋白的溶解度和電荷分布，因而其值的變化對卵黃高磷蛋白乳化特性也產(chǎn)生影響。在pH3～10，除pH 5和pH 10外，其余pH值變化可以顯著(P＜0.05)影響卵黃高磷蛋白乳化穩(wěn)定性(68% ～73%)，但是單純pH值變化對卵黃高磷蛋白的乳化活性影響不顯著。然而，向卵黃高磷蛋白中添加NaCl后，卵黃高磷蛋白的電荷分布會進一步改變進而降低其在pH3和9時的乳化活性，以及pH 3～9時的乳化穩(wěn)定性［13］。

卵黃高磷蛋白的乳化活性對體系環(huán)境的溫度變化比較敏感。當(dāng)乳化體系的溫度高于65℃時，卵黃高磷蛋白的乳化活性就會降低［15］;相對而言，卵黃高磷蛋白的乳化穩(wěn)定性受溫度的影響不會太強烈。實驗證明，即使乳化體系環(huán)境溫度在低于67.5℃下保持60 min，蛋白的乳化穩(wěn)定性也不會受到顯著(p＜0.05)影響。當(dāng)?shù)鞍兹芤涸?0、80，甚至96℃下加熱處理60 min后，蛋白的乳化穩(wěn)定性才下降［15］。

除此之外，卵黃高磷蛋白溶液中金屬離子的存在也會影響蛋白的乳化特性。Castellani等人［16］指出，非聚合的卵黃高磷蛋白具有更好的乳化特性，而聚合的卵黃高磷蛋白具有更好的乳化穩(wěn)定性。隨著研究的深入，Castellani等人［17］還發(fā)現(xiàn)，除前述鈣離子外，鎂離子和鐵離子的存在也會影響卵黃高磷蛋白形成乳化液體系。含有鎂離子的卵黃高磷蛋白乳化液在pH 6和pH 7時會產(chǎn)生高度的絮凝狀態(tài)，EDTA(乙二胺四乙酸)的添加則可以部分消除絮凝現(xiàn)象，但是在制備乳化液之前添加EDTA，絮凝現(xiàn)象就可以完全消除。在卵黃高磷蛋白的乳化液體系中添加鐵離子也會在pH值為4～7時產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象，尤其在pH 6和pH 7時最為顯著。濃度為4.8 mmol/L EDTA的可以部分消除絮凝現(xiàn)象。單獨添加SDS(十二烷基硫酸鈉)不足夠解聚絮凝的油滴，只有同時添加SDS和EDTA才能徹底消除體系的絮凝現(xiàn)象。與卵黃高磷蛋白相比較，鐵離子-卵黃高磷蛋白復(fù)合物具有較低的乳化性;與乳化后加入鐵離子比較，乳化前加入鐵離子產(chǎn)生相對較少的絮凝現(xiàn)象。

3 酶處理對卵黃高磷蛋白乳化性的影響

酶解蛋白質(zhì)使其生成肽段，不僅改變了蛋白的組分，同時還會引起二級結(jié)構(gòu)的變化，進而引起蛋白物理化學(xué)特性的變化。Sattar Khan等人［18］的研究表明，蛋白酶將卵黃高磷蛋白水解成大肽鏈(高磷酸化核心區(qū)50～210個肽)和小肽鏈(N端1～49個肽和C一端211～217個肽)。不含小肽的大肽部分不具備優(yōu)異的乳化特性，這說明蛋白質(zhì)中的N末端 和C末端部分是蛋白質(zhì)高乳化性的關(guān)鍵。張小燕等人［19］的研究得到了相同的結(jié)論，蛋白酶水解后及磷酸酶處理后的卵黃高磷蛋白不再具備優(yōu)良的乳化性，進而證實卵黃高磷蛋白的C末端和N末端以及大量的磷酸根基團都是維持其高乳化性不可或缺的部分。

4 添加劑對卵黃高磷蛋白乳化性的影響

蛋白的乳化特性還可以通過加入添加劑如:果膠［20］、甘油［21］和海藻糖［22］等來改善。陳海英等人［26］研究表明，卵黃高磷蛋白溶液中添加0.5%的甘油就可以顯著的使其乳化活性指數(shù)從19.8提高到20.9，乳化穩(wěn)定指數(shù)從67.6到75.1。添加0.1%(酯化度為34% ～40%)果膠或者是0.5%的海藻糖，也可以提高卵黃高磷蛋白的乳化穩(wěn)定指數(shù)。在其他蛋白形成的乳化體系中，上述添加劑也有類似的研究報道。Akhtar等人［20］的研究表明，70%酯化度的果膠可以在酸性條件下形成食品乳化體系。低濃度的果膠有利于適度稀釋乳化體系中血清蛋白的快速分離以及由酪蛋白形成的濃縮型乳化體系的假塑性流變學(xué)特性［4］。同時研究還表明，甘油也可以作為乳化劑、組織形成劑和塑型劑來改善食品和乳化體系的質(zhì)地［21］。共溶劑如甘油等可以增加水相體系中蛋白的穩(wěn)定性，當(dāng)?shù)鞍兹苡诟视?水體系中時，甘油優(yōu)先與大塊連續(xù)性的疏水性區(qū)域相結(jié)合，因為甘油在疏水性界面和極性溶劑中充當(dāng)兩性分子［23］;也有研究表明，甘油濃度與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互體系中表面的疏水性和熒光性之間是相互促進關(guān)系［24］。海藻糖(α，α-海藻糖)是一個非還原性二糖，由α-1，1糖苷鍵連接2個葡萄糖分子形成，它無水時的分子質(zhì)量與乳糖相似。它可以在干燥條件下被用作密封劑，來阻止生物材料蒸發(fā)、氧化和化學(xué)反應(yīng)。海藻糖的封裝特性在一定程度上與其乳化體系在脫水性前的乳化穩(wěn)定性相關(guān)［25］。最新的研究表明，水相中乳化劑的穩(wěn)定性還可以受到海藻糖濃度的影響。海藻糖可以消除體積-質(zhì)量 平均直徑(d4，3)和極大增加乳化穩(wěn)定性［22］。

5 改性反應(yīng)對卵黃高磷蛋白乳化性的影響

美拉德反應(yīng)，碳水化合物的還原性末端與蛋白質(zhì)的ε-氨基之間的縮合反應(yīng)，經(jīng)常被用來提高食品中蛋白質(zhì)的物理特性，包括乳化特性，如溶菌酶及酪蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性［20］。但是通常情況下，必須控制美拉德反應(yīng)在初級階段以減少復(fù)雜的高級產(chǎn)物、較深的顏色以及不良氣味的產(chǎn)生。目前，美拉德反應(yīng)提高大豆蛋白［27］、酪蛋白［28］、溶菌酶［29］等蛋白的乳化性得到了驗證，但是，關(guān)于卵黃高磷蛋白的美拉德反應(yīng)的研究還不常見。

Nakamura等人［30］通過美拉德反應(yīng)分別使卵黃高磷蛋白及其蛋白酶水解產(chǎn)物與半乳甘露聚糖連接，然后比較兩者乳化性能的變化，前者的乳化活性及乳化穩(wěn)定性都得到了顯著地提高，而后者變化不大。原因在于卵黃高磷蛋白可以被高度糖基化，而其酶解得到的含有高度磷酸化結(jié)構(gòu)的肽片段結(jié)合的半乳甘露聚糖較少。蛋白質(zhì)和葡聚糖都具有穩(wěn)定油水乳化體系的作用，同時，葡聚糖還可以通過增稠作用及膠黏效應(yīng)以提高連續(xù)相的穩(wěn)定性，顯而易見，卵黃高磷蛋白-葡聚糖聚合物可以提高蛋白的乳化特性。與此相反，卵黃高磷蛋白的N末端和C末端集中了卵黃高磷蛋白中近一半的疏水氨基酸殘基，可以錨定油滴，使其均勻分散在水相中，酶解后疏水N末端和C末端被破壞，進而降低了其乳化特性。

6 結(jié)論與展望

目前，我國已經(jīng)成為禽蛋生產(chǎn)大國，產(chǎn)量己連續(xù)18年居世界第一位。但是我國蛋制品的深加工程度與巨大的蛋產(chǎn)量極不同步。我國的蛋品加工量不足產(chǎn)量的5%，而用于深加工的只占0.7% ～1%，存在加工能力弱，加工深度低，品種單一等方面的問題。

雞蛋，特別是蛋黃中存在著大量的活性物質(zhì)，如蛋黃油，核黃素，卵黃高磷蛋白，蛋黃卵磷脂，唾液酸等高附加值的生理功能成分。功能成分的提取分離以及功效應(yīng)用的研究已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。卵黃高磷蛋白是存在于蛋黃顆粒中一種活性蛋白，因其優(yōu)異的金屬離子吸附能力、乳化特性、抗氧化、抑菌性、耐高溫等特性而成為全世界范圍的研究新寵。隨著卵黃高磷蛋白及其產(chǎn)品性質(zhì)研究的深入，以及卵黃高磷蛋白大規(guī)模提取分離工藝的改進，卵黃高磷蛋白的開發(fā)應(yīng)用的成本大幅度降低，進一步擴大其在食品、醫(yī)藥、護膚品等工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模。

卵黃高磷蛋白作為乳化劑使用時依然存在著缺陷，如卵黃高磷蛋白的疏水性末端比較小，限制了其對油脂的吸附，進而影響了乳化活性;卵黃高磷蛋白沒有分支結(jié)構(gòu)，不能夠形成強大的空間位阻效應(yīng)，不足夠阻止乳化液滴的絮凝，進而也限制了其乳化穩(wěn)定性。針對以上問題，國內(nèi)外的科研人員從多方面作出了努力，但是這依然是一個炙手可熱的研究課題。作者認為，對卵黃高磷蛋白自身的改性，如酶法聚合、接枝反應(yīng)等將會是解決上述問題的一個有效途徑。

［1］ 倪利，王璋，許時嬰.雞蛋中卵黃高磷蛋白的提?。跩］.無錫輕工大學(xué)學(xué)報，1999，18(2):55-59.

［2］ Taborsky G.Phosphoproteins ［J］.Advances in Protein Chemistry，1974，28:1-210.

［3］ Byrne B，van het Schip A，van de Klundert J，et al.Amino acid sequence of phosvitin derived from the nucleotide sequence of part of the chicken vitellogenin gene［J］.Biochemistry，1984，23:4 275-4 279.

［4］ Dickinson E，Golding M.Influence of calcium ions on creaming and rheology of emulsions containing sodium caseinate［J］.Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects，1998，144:167-177.

［5］ Day L，Xu M，Hoobin P，et al.Characterization of fish oil emulsions stabilized by sodium caseinate［J］.Food Chemistry，2007，105:469-479.

［6］ Dickinson E，Golding M.Depletion flocculation of emulsions containing unadsorbed sodium caseinate ［J］.Food Hydrocolloids，1997a，11(1):13-18.

［7］ Dickinson E，Golding M.Rheology of sodium caseinate stabilized oil-in-water emulsions［J］.Journal of Colloidal and Interface Science，1997b，191:166-176.

［8］ Kato A，Miyazaki S，Kawamoto A，et al.Effect of phosphate residues on the excellent emulsifying properties of phosphoglycoprotein phosvitin ［J］.Agricuture，Biological and Chemitry，1987，51(11):2 989-2 994.

［9］ Castellani O，Belhomme C，Briand，E D，et al.Oil-inwater emulsion properties and interfacial characteristics of hen egg yolk phosvitin ［J］.Food Hydrocolloids，2006，20:35-43.

［10］ Timasheff X N，Townend R，＆ Perlmann G E.The circular dichroism of phosvitin［J］.Issue of May，1967，10，242(9):2 290-2 292.

［11］ Castellani O，Belhomme C，Briand E D，et al.The role of metal ions in emulsion characteristics and flocculation behaviour of phosvitin-stabilised emulsions ［J］.Food Hydrocolloids，2008，22:1 243-1 253.

［12］ Chung S L，F(xiàn)errier L K.Conditions affecting emulsifying properties of egg yolk phosvitin［J］.Journal of Food Sci-ence，1991，56(5):1 259-1 262.

［13］ Chung S L，F(xiàn)errier L K.pH and sodium chloride effects on emulsifying properties of egg yolk phosvitin［J］.Journal of Food Science，1992，57(1):40-42.

［14］ Belhomme C，Briand E D，Ropers M H，et al.Interfacial characteristics of spread films of hen egg yolk phosvitin at the air-water interface:Interrelation with its charge and aggregation state ［J］.Food Hydrocolloids，2006，21:896-905.

［15］ Chung S L，F(xiàn)errier L K.Heat Denaturation and Emulsifying Properties of Egg Yolk Phosvitin［J］.Journal of Food Science，1995，60(5):906-908.

［16］ Castellani O，Briand E D，Dubiard C G，et al.Effect of aggregation and sodium salt on emulsifying properties of egg yolk phosvitin ［J］.Food Hydrocolloids，2005，19:769-776.

［17］ Castellani O，Belhomme C，Briand E D，et al.The role of metal ions in emulsion characteristics and flocculation behaviour of phosvitin-stabilised emulsions ［J］.Food Hydrocolloids，2008，22:1 243-1 253.

［18］ Sattar Khan M A，Babiker E E，Azakami H，et al.Effect of protease digestion and dephosphorylation on high emulsifying properties of hen egg yolk phosvitin ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46:4 977-4 981.

［19］ 張小燕，范曉東，高新，等.酶水解和脫磷對卵黃高磷蛋白高乳化性的影響［J］.化學(xué)通報，2005(4):304-308.

［20］ Akhtar M，Dickinson E，Mazoyer J，et al.Emulsion stabilizing properties of depolymerized pectin ［J］.Food Hydrocolloids，2002，16:249-256.

［21］ Mirhosseini H，Tan C P，Taherian A R.Effect of glycerol and vegetable oil on physicochemical properties of Arabic gum-based beverage emulsion［J］.European Food Research and Technology，2008，228:19-28.

［22］ Cerimedo M，Iriart C H，Candal R J，et al.Stability of emulsions formulated with high concentrations of sodium caseinate and trehalose ［J］.Food Research International，2010，43:1 482-1 493.

［23］ Vagenende V，Yap M G S，Trout B L.Mechanisms of protein stabilization and prevention of protein aggregation by glycerol［J］.Biochemistry，2009，48:11 084-11 096.

［24］ Sahu R K，Prakash V.Mechanism of prevention of aggregation of proteins:a case study of aggregation of α-globulin in glycerol［J］.International Journal of Food Properties，2008，11:613-623.

［25］ Vega C，Goff H D，Roos Y H.Casein molecular assembly affects the properties of milk fat emulsions encapsulated in lactose or trehalose matrices［J］.International Dairy Journal，2007，17:683-695.

［26］ Chen H，Wu F，Duan X，et al.Characterization of emulsions prepared by egg yolk phosvitin with pectin，glycerol and trehalose［J］.Food Hydrocolloids，2013，1(30):123-129.

［27］ Diftis N，Kiosseoglou V.Physicochemical properties of dry-heated soy protein isolate-dextran mixtures［J］.Food Chemistry，2006，96:228-233.

［28］ Mu M，Pan X，Yao P，et al.Acidic solution properties of β-casein-graft-dextran copolymer prepared through Maillard reaction［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2006，301:98-106.

［29］ Nakamura S，Kato A，Kobayashi K.New antimicrobial characteristics of lysozyme-dextran conjugate［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1991，39:647-650.

［30］ Sattar Khan M A，Babiker E E，Azakami H，et al.Molecular mechanism of the excellent emulsifying properties of phosvitin-galactomannan conjugate［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47:2 262-2 266.