宰后骨骼肌內(nèi)環(huán)境對caspase-3活化的潛在影響因素綜述*

曹錦軒，張玉林，黃鴻兵，廖國周，潘道東

1(寧波大學食品科學與工程系，浙江 寧波，315211);2(江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京，210017)3(云南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，云南昆明，650201)

肉類企業(yè)調(diào)查表明，嫩度是肉最重要的品質(zhì)指標之一。肉品的嫩度在宰后貯藏過程中能得到顯著改善，這與特殊的細胞骨架蛋白降解有關(guān)［1-2］。這些骨架蛋白被認為是nebulin和titin 2種大蛋白，以及一些小蛋白，例如 integrin，desmin 和 troponin T［3-5］。3種蛋白酶系統(tǒng)在嫩化過程中的作用曾經(jīng)被報道過，分別是組織蛋白酶、鈣激活酶和泛素蛋白酶體［4］。此外，近年的研究表明，細胞凋亡關(guān)鍵酶caspase-3也能在成熟過程中對細胞骨架蛋白起到降解作用。最近的研究顯示，宰后肌肉的缺血環(huán)境導致骨骼肌細胞凋亡的發(fā)生，以及caspase-3在成熟過程中被顯著激活［6］。同時，對caspase-3活化途徑的研究顯示，介導外源途徑的caspase-8在宰后發(fā)生了活化;介導線粒體途徑的細胞色素C宰后濃度顯著升高，caspase-9也產(chǎn)生了活化條帶［6］。然而，caspase-3活化的整個過程仍然缺乏深入了解，影響caspase-3活化的宰后肌肉生理生化因素目前尚未進一步研究。弄清宰后細胞內(nèi)環(huán)境因子對caspase酶家族活化的影響，有利于肉品科學家對宰后肌肉轉(zhuǎn)化成肉的過程中細胞骨架降解及肉品品質(zhì)的變化機制有一個進一步的理解。

本文綜合近年來畜禽宰后肌肉生化變化的現(xiàn)象，以及醫(yī)學與細胞生物學有關(guān)caspase-3活化的生理代謝特征相關(guān)研究內(nèi)容，對caspase-3的活化途徑及潛在對其產(chǎn)生影響的生物化學因素進行了介紹。

1 Caspase-3的活化途徑

Caspase-3通常以32 ku無活性的酶原形式存在大多數(shù)動物細胞中，酶原本身沒有活性，必須經(jīng)特定的途徑被激活后才能引起細胞凋亡和蛋白降解。Caspase-3在執(zhí)行者上處于核心地位，是細胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟及一切凋亡信號傳導的共同通路。早期的Western blotting研究顯示，32 ku的caspase-3酶原，在宰后1天的3種牛骨骼肌中被降解產(chǎn)生18/20 ku的活力片斷。Kemp等［7］研究了宰后5 min的豬肉，發(fā)現(xiàn)了20 ku的片段，但并沒有發(fā)現(xiàn)18 ku活化片斷，這可能是由于這個2個條帶分子質(zhì)量太相近，蛋白電泳沒有充分分開。Underwood等［8］的研究并沒有檢測到牛背最長肌酶原的降解片斷，可能由于降解條帶信號不夠強，或者抗體稀釋倍數(shù)小、蛋白進樣量以及信號檢測時放大與捕捉得不夠。黃明等采用抑制劑處理和體外孵育等研究手段表明，caspase-3和caspases-6對雞肉肌原纖維蛋白有顯著降解作用［9-11］。

目前Caspase-3已知的激活途徑有2種，一種被稱為外源性的死亡受體途徑或caspase-8途徑，由胞外“死亡配體”觸發(fā)“死亡受體”，通過級聯(lián)反應激活外源性途徑的起始caspase-8，caspase-8進一步導致線粒體膜通透性增強、細胞色素C的釋放和caspase-9的激活，最終激活 caspase-3［12-13］。另外一種途徑被稱為內(nèi)源性途徑或者線粒體途徑，它是由細胞內(nèi)部的凋亡信號誘導線粒體膜通透性改變，釋放到胞質(zhì)中的細胞色素C、Apaf-1(apoptotic peptidase activating factor-1)和caspase-9相互作用，再與輔因子ATP(或dATP)結(jié)合，形成凋亡復合體，活化的caspase-9降解并激活caspase-3［14-15］。研究中發(fā)現(xiàn)，在腰小肌和半腱肌中，caspase-9、caspase-8酶活與 caspase-3活力呈顯著相關(guān)性，且它們的酶活最高水平都發(fā)生在caspase-3之前［6］。與此同時，還發(fā)現(xiàn)了 caspase-9、caspase-8的活化片段［6］。在caspase-9活化片斷的抗體檢測中發(fā)現(xiàn)了23 ku的活化亞基，這個片段與之前Shiozaki等［15］在離體培養(yǎng)的細胞中檢測到的類似;在Western blotting的研究結(jié)果中，caspase-8酶原在宰后1天的3種牛骨骼肌中，被降解成45/38 ku的中間產(chǎn)物和一個類似18 ku的22 ku活化片斷，與先前報道的caspase-8一開始被加工成一個10 ku的小片段和43/41 ku的中間產(chǎn)物片段，隨后這個中間產(chǎn)物片段被降解成一個18 ku的活力片斷相似［16］。

這些研究結(jié)果表明，宰后缺血、缺氧環(huán)境激活了caspase-8和-9，caspases-8和 -9兩種途徑均參與了caspase-3酶原的活化，但這2種途徑在宰后環(huán)境的變化過程中，何時何種途徑起主導作用及分別受哪些內(nèi)環(huán)境因子的影響，還有待于深入研究。

2 宰后潛在影響caspase-3活化的細胞生物化學因素分析

宰前應激以及宰后放血都會使畜禽肌肉細胞處于極端生存環(huán)境(缺氧、ATP消耗、乳酸積累等)下，不可避免地對細胞生理代謝產(chǎn)生重大影響，導致肌漿網(wǎng)Ca2+釋放至胞液，氧氣缺乏產(chǎn)生自由基，引起肌細胞收縮，糖元無氧酵解產(chǎn)生少量ATP并迅速消耗、產(chǎn)生乳酸導致pH值在一定時期顯著下降，以及鈣激活蛋白酶、組織蛋白酶的激活、肌細胞骨架蛋白降解等。這些宰后生理生化變化均可能對caspase-3的活化過程及酶活力有一定的影響。

2.1 細胞色素C

許多死亡誘導信號，如活性氧簇(ROS)的介導，線粒體氧化還原電位的破壞，細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高等，均能誘發(fā)線粒體細胞色素C的釋放［14］。早期的研究表明，牛肉背最長肌，半腱肌和腰小肌的胞漿細胞色素C含量在宰后第1天顯著升高。目前，細胞色素C釋放的機制主要有3種學說:線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔(MPTP，mitochondrial permeability transition pore)的開放、線粒體外膜上特異性通道形成及線粒體外膜機械性破壞［17］。MPTP有非特異性通透及可調(diào)控性開放的特點，主要由線粒體膜的結(jié)構(gòu)性成分組成，MPTP假說的支持者認為MPT是細胞色素C釋放所必需的。線粒體外膜上特異性通道假說認為細胞色素C的釋放不依賴于MPTP的開放，抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員或Bcl-2家族成員與線粒體外膜其他蛋白相互作用形成的特異性通道能透過并導致細胞色素C的釋放。線粒體外膜機械性破壞是指凋亡誘導因子使線粒體膜脂質(zhì)和蛋白損傷，導致線粒體內(nèi)質(zhì)子梯度及滲透壓平衡失調(diào)，線粒體內(nèi)基質(zhì)空間顯著增大，使線粒體外膜破裂和細胞色素C釋放［18］。

caspase-3與細胞色素 C相關(guān)的活化機制為:一方面線粒體釋放到胞漿中的細胞色素 C可通過與Apaf-1結(jié)合，活化caspase-9進而激活caspase-3;另一方面活化的caspase-3可通過對胞漿底物的裂解促進細胞色素C釋放。由于不同物種及肌肉部位的紅肌和白肌比例存在差異，導致線粒體豐富程度及細胞色素C表達量不太一致，凋亡相關(guān)蛋白水平、宰后線粒體膜完整程度變化上的差異，最終會影響細胞色素C的釋放和宰后caspase-3活化情況的差異，也可能是造成宏觀品質(zhì)差異的因素之一。

2.2 宰后肌肉表面氧濃度

缺氧曾經(jīng)在醫(yī)學被廣泛報道對骨骼肌細胞有非常嚴重的損傷。慢性阻塞性肺疾病、呼吸窘迫綜合征、心臟衰竭以及嚴重的肺炎等疾病均被報道能引起組織缺氧，而最終導致肌肉受損［19］。近年來醫(yī)學研究表明，缺氧導致肌肉受損的原因是促進了骨骼肌細胞線粒體ROS和活性氮的產(chǎn)生［20］。ROS是一類具有高活性的氧化還原中間產(chǎn)物，包括O2-·、H2O2、HO2·、·OH等。線粒體是細胞中產(chǎn)生ROS的一個重要場所，其產(chǎn)生的速率主要受線粒體跨膜電位的控制。在正常生理情況下線粒體產(chǎn)生的ROS約消耗2%的氧，并生成ROS的前體超氧陰離子和過氧化氫，它們是由呼吸鏈底物端漏出的電子引起氧分子單電子還原而生成的，線粒體中ROS的產(chǎn)生部位是呼吸鏈的底物端。組織在宰后缺血情況下，盡管氧氣含量低，但線粒體的氧化還原狀況受到了削弱，促使電子傳遞鏈向殘留的氧氣傳遞電子，最終會促進ROS形成。

醫(yī)學缺氧模型研究表明，缺氧過程中形成的ROS對caspase的活化、細胞的死亡方式以及骨架蛋白的降解起到關(guān)鍵作用。骨骼肌缺氧缺血條件下，細胞色素C的釋放被認為與ROS有關(guān)。ROS能促進細胞色素C的釋放，原理是氧化線粒體內(nèi)膜外側(cè)的心磷脂，削弱心磷脂與細胞色素C的連接;同時，ROS通過對線粒體膜通道蛋白如，VDAC(voltage-dependent anion-selective channel)、ANT(adenine nucleotide translocase)和cypD(cyclophilin D)等的氧化修飾，以及H2O2導致線粒體膜電位(Δψm)的崩解，導致了細胞色素C的釋放，進一步活化caspase-9，啟動caspase系統(tǒng)的活化［21］。Delivoria-Papadopoulos 等［22］的研究表明，介導caspase-9活化的凋亡蛋白酶活化因子I的ATP和細胞色素C的結(jié)合位點在缺氧過程中發(fā)生了變化;依賴于細胞色素C的caspase-9的活化在缺氧過程中顯著增強。然而，ROS的過度生成盡管也能導致細胞色素C的釋放，卻會導致caspase的活力下降。外源與內(nèi)源性 H2O2均能氧化 caspase-3，-8和-9活性位點的半胱氨酸殘基從而削弱酶活。Ueda等［23］采用150～200 mmol的 ROS誘導劑 diamide處理培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn)ROS的生成誘導細胞色素C的釋放以及caspase-3的活化;然而劑量提高到500 mmol后，盡管 ROS也有生成，細胞色素 C也能釋放，但caspase-3卻得不到活化。這是由于ROS過量產(chǎn)生導致細胞整體氧化還原狀態(tài)破壞，最終caspase-3，-8和-9活性位點的半胱氨酸殘基氧化從而削弱酶活。

2.3 肌漿中鈣離子濃度

肌細胞中的鈣離子基本不以游離的形態(tài)存在，而與肌質(zhì)網(wǎng)、線粒體、肌動蛋白等結(jié)合。宰后肌纖維中亞細胞功能遭到破壞，肌質(zhì)網(wǎng)功能失常，發(fā)生崩解，失去鈣泵的作用，內(nèi)部保存的鈣離子被釋放出來，致使肌漿中的鈣離子濃度在宰后迅速升高［24］。Nakamura［25］發(fā)現(xiàn)，雞胸肉中游離鈣離子濃度宰前活體為60 μmol/L，宰后 24 h 增加到180 μmol/L。Ji等［26］用勻漿質(zhì)原子吸收分光光度法測定了雞胸肉中游離鈣離子的濃度由宰后20 min的70 μmol/L，在18 h后達到220 μmol/L的最大濃度;豬肉中鈣離子濃度由宰后40 min的28μmol/L在宰后3 d后達到210μmol/L的最大值，牛肉中由宰后40 min的26 μmol/L在4 d后達到最大值210 μmol/L。以上數(shù)值顯示，宰后胞漿鈣離子最終濃度在210～230 μmol/L這樣一個狹長的范圍變化，最終濃度與肉品的種類有關(guān)。

宰后胞漿鈣離子濃度的升高，誘發(fā)的信號與級聯(lián)反應的發(fā)生和后續(xù)放大，非常有可能會對caspase的活化產(chǎn)生影響。首先，caspase-9活性對于外源的鈣離子是敏感的。外源性5 mmoL鈣離子處理能導致caspase-9活性4.86倍的增加，這可以被150 mmol的KCl所抑制［27］。其次，有研究認為鈣離子通過 calpains來調(diào)節(jié)caspases活性，但也有研究認為，calpains可能通過直接降解調(diào)節(jié) caspases活性。Gafni等［28］發(fā)現(xiàn)，calpain處理導致caspase-7活性的增加。calpain裂解procaspase-7產(chǎn)生了一個18.5 ku的大亞基和17.2 ku的亞基，其中較小的亞基相對于由caspase-3降解caspase-7產(chǎn)生的20 ku的大亞基其活性增加更強烈。不論鈣離子是直接作用于caspase還是通過calpains來調(diào)節(jié)caspases活性，以上研究都表明鈣離子對caspase-3的活化有影響，但具體途徑缺乏深入研究。

2.4 肌肉pH值

缺氧條件下糖原酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的丙酮酸，不能進入三羧酸循環(huán)進一步氧化最后生成乳酸，而產(chǎn)生的乳酸不能經(jīng)過血液循環(huán)運輸?shù)叫呐K，從而導致乳酸在組織內(nèi)逐漸積累、胴體pH值下降。Henckel等［29］分析了宰后豬肉背最長肌糖原和乳酸的含量，發(fā)現(xiàn)糖原含量宰前為70 mmol/kg左右，宰后3 h降解掉1/3左右，24 h分解掉2/3左右;而乳酸的含量，則由宰前的10 mmol/kg左右，宰后24 h迅速增加了10倍左右。作者曾研究了牛肉中半腱肌、背最長肌和里脊中pH值的變化情況，發(fā)現(xiàn)3種不同部位肌肉的pH值宰后迅速下降至酸性，24 h達到極限pH值，且下降程度部位之間存在差異。

許多研究報道，細胞凋亡的發(fā)生、caspase-3的活化通常伴隨著胞漿的酸化(acidification)，缺氧條件下，當pH值紊亂(pH paradox)下降到6.3時，細胞線粒體膜的通透性會增大［30］。氫離子的濃度變化，對于線粒體凋亡途徑中Apaf-1、細胞色素C和caspases三者之間的結(jié)合，以及caspases的活化過程有非常大的影響。但目前氫離子濃度對控制細胞色素C釋放的機制尚不清楚。細胞內(nèi)pH值降低還會導致鈣超載的形成［31］，引起一系列細胞連鎖反應。許多研究報道表明，一般情況下pH值降低大約在0.3～0.4個單位，對細胞凋亡發(fā)生、Caspase-3活化有顯著影響，但目前氫離子濃度對控制Caspase活化的機制尚不清楚［32］。

2.5 肌細胞ATP水平

在動物宰殺放血以后，由于氧氣供應中斷和糖原的快速消耗，無氧代謝使得細胞內(nèi)ATP迅速減少。Henckel等［29］報道，豬肉宰前骨骼肌的 ATP含量為4.5 mmol/kg左右，在宰后3 h含量降低到宰前的1/3，宰后15 h下降到0.5 mmol/kg，宰后24 h的 ATP的含量只剩下0.05 mmol/kg。本研究結(jié)果表明，3種不同部位肌肉的肌細胞內(nèi)的ATP在宰后30 min～14 h顯著降低，且能量代謝在18 h內(nèi)完成。

細胞受刺激后發(fā)生凋亡還是壞死，很大程度上取決于細胞內(nèi)ATP水平。如細胞色素C釋放后，在細胞內(nèi)ATP存在情況下可通過激活Caspase來介導細胞凋亡;如釋放后細胞內(nèi)ATP不能維持適當?shù)乃?，則細胞發(fā)生壞死［33-34］。Delivoria-Papadopoulos 等［20］證明了在缺氧條件下，活化態(tài)caspases的表達量在外源加入ATP、細胞色素C和ATP+細胞色素C的條件下，分別增加了30%、45%和60%。Liu等［35］表明，ATP含量的降低直接阻止了上游caspases的活化，一定程度抑制了下游caspase-3的活化能力，從而導致細胞凋亡的受阻。Eguchi等［33］指出，ATP的消耗導致了Fas誘導的caspase-3活化受到嚴重阻滯。這些研究表明ATP是caspase活化的必要條件。

對牛骨骼肌的初步研究表明，宰后前14 h肌細胞尚有部分ATP可供利用，這個時期的細胞環(huán)境比較有利于上游 caspase-9的活化。盡管探討了caspase-3活化的2個通路，并通過宰后ATP類核苷酸水平的變化分析推斷ATP可能對caspase-3的活化有一定影響，但ATP究竟在宰后哪一階段的變化，對應影響了caspase-3活化通路的哪個步驟，或者哪幾個步驟，仍然有待進一步研究來印證。

3 總結(jié)

骨骼肌細胞內(nèi)酶原形態(tài)的caspase-3可能在宰后24 h內(nèi)得到有效活化，其活化途徑可能受體調(diào)節(jié)的caspase-8及線粒體細胞色素C調(diào)節(jié)的caspase-9兩個途徑。缺氧生成的ROS可能通過促進細胞色素C釋放進而啟動caspase-3活化，然而，ROS的過量產(chǎn)生可以導致caspase-3活性位點的半胱氨酸殘基氧化從而削弱酶活;宰后胞漿鈣離子濃度的升高可能直接導致caspase-9活性增加，也可能通過 calpains來調(diào)節(jié)caspase-3活性，但具體過程缺乏深入研究;宰后pH值下降可能會線粒體膜的通透性增大以及影響Apaf-1、細胞色素 C和 caspase三者之間的結(jié)合，對caspase-3活化有顯著影響，但目前具體機制尚不清楚;宰后一定時期ATP的存在有利于caspase-3的活化，但隨后ATP含量降低可能直接阻止了上游caspases的活化，進而抑制了下游caspase-3的活化能力，但ATP究竟在宰后哪一階段的變化，對應影響了caspase-3活化通路的哪些步驟，仍然需要進一步研究來揭示。

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