乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

李陽 劉巍

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)起源于原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶，存在于腫瘤患者外周血中，雖然其在外周血中所占比例很?。?］。研究發(fā)現(xiàn)檢測(cè)CTCs不僅能反映腫瘤負(fù)荷，還能預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)，多種腫瘤中CTCs陽性者生存率明顯低于陰性者，在治療期間定期檢測(cè)并監(jiān)測(cè)CTCs的變化，可為評(píng)價(jià)治療方案的敏感性提供依據(jù)，并且可以作為靶向治療的靶標(biāo)，有利于開展個(gè)體化的治療［1］。越來越多的醫(yī)學(xué)工作者開始關(guān)注CTCs，本文就相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 CTCs

1869年，Ashworth在1例癌癥死亡患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了相似腫瘤的細(xì)胞，并提出了CTCs的概念［2］。目前的腫瘤轉(zhuǎn)移理論認(rèn)為，隨著腫瘤細(xì)胞不斷增殖，部分腫瘤細(xì)胞失去相互黏附的能力，從腫瘤母體脫離，浸潤周圍組織，甚至進(jìn)入到血液或淋巴系統(tǒng)中。腫瘤細(xì)胞脫落、侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，并為形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了可能，因此在外周血中檢測(cè)循CTCs具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。CTCs的檢測(cè)有助于早期轉(zhuǎn)移腫瘤患者的診斷、監(jiān)測(cè)術(shù)后患者腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、評(píng)估抗腫瘤藥物敏感性、患者預(yù)后［3］以及選擇個(gè)體化的治療策略。

2 CTCs檢測(cè)方法

CTCs在外周血中所占比例很小［4］?，F(xiàn)有針對(duì) CTCs的檢測(cè)技術(shù)主要包括細(xì)胞富集和鑒定兩個(gè)階段。細(xì)胞富集主要用物理、化學(xué)原理，細(xì)胞鑒定主要依靠腫瘤細(xì)胞存在的腫瘤特異性或器官特異性標(biāo)記以及腫瘤細(xì)胞本身的形態(tài)學(xué)特征等。選擇兩個(gè)階段的不同方法并加以有效結(jié)合，最終尋找出敏感度和特異性較高的簡(jiǎn)便、精確的方法。

2.1 細(xì)胞篩選/富集技術(shù) 富集方法通常是CTCs物理性質(zhì)(密度和大小)或免疫磁性的分選，常用的細(xì)胞富集技術(shù)主要包括密度梯度離心法、過濾法、免疫磁性分選技術(shù)(Immunomagnetic Separation，IMS)。因ISM利用免疫磁珠結(jié)合活性蛋白質(zhì)和被磁鐵所吸引的特性，依靠被分離細(xì)胞上抗原與包被磁珠的抗體的特異性反應(yīng)形成抗原—抗體、磁珠免疫復(fù)合物。借助外加磁場(chǎng)完成對(duì)CTCs的篩選/富集。這類技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于分選過程避免了細(xì)胞裂解，但需借助細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物作為篩選的靶標(biāo)，所以靶標(biāo)的表達(dá)狀況會(huì)影響分析方法的敏感性和特異性，且缺乏標(biāo)準(zhǔn)步驟及反應(yīng)試劑等［5］。

2.2 腫瘤細(xì)胞鑒定技術(shù) 常用的鑒定檢測(cè)技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(Immunocytochemistry，ICC)、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)和流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)等。RT-PCR是目前檢測(cè)CTCs比較有效的方法，具有高效、高敏感、高特異性等優(yōu)點(diǎn)。但由于測(cè)定過程需破壞 CTCs，因此無法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。ICC的基本機(jī)制是抗原抗體反應(yīng)，利用單克隆抗體和特異性腫瘤標(biāo)志物相結(jié)合，通過酶與底物反應(yīng)顯色判斷腫瘤細(xì)胞的是否存在，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行定量、定性、定位分析。其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，直觀，缺點(diǎn)是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表面抗原表達(dá)不均一，影響了檢測(cè)的敏感度，亦可能出現(xiàn)假陽性率。FCM是以流式細(xì)胞儀作為工具，對(duì)懸液中的細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量和分析其優(yōu)點(diǎn)是快速、定量，卻不能提供細(xì)胞形態(tài)等方面的信息，尚不能很好的區(qū)別腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。鑒于以上方法尚不能單獨(dú)提供足夠的高特異性，因此為增加CTCs檢測(cè)方法的特異性及敏感性，Gilbey等［6］認(rèn)為多聯(lián)合應(yīng)用不同檢測(cè)方法是非常有必要的。

2.3 微流控分析芯片技術(shù) 隨著微流控和微機(jī)械加工技術(shù)(MEMS)的不斷完善和發(fā)展，微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞水平上的生物學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷等領(lǐng)域里的優(yōu)勢(shì)日趨顯著。微流控芯片又稱芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-a-Chip)，是將生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成或基本集成在一塊芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)。雖然微流控芯片技術(shù)進(jìn)行 CTCs檢測(cè)還在起步階段，但此技術(shù)的出現(xiàn)卻為CTCs檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了新的方法和思路。

3 CTCs檢測(cè)乳腺癌的臨床應(yīng)用

世界范圍內(nèi)乳腺癌已經(jīng)成為女性最常見的惡性腫瘤［7］。在我國尤其是大城市里，乳腺癌的發(fā)病率也逐漸上升，其中復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者主要的致死因素。血行播散是乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提，因此乳腺癌是最早用來研究CTCs的，研究發(fā)現(xiàn)CTCs不僅存在于轉(zhuǎn)移的患者中，在非轉(zhuǎn)移的患者的循環(huán)系統(tǒng)中同樣存在［8］，也是當(dāng)前研究的較成熟的腫瘤。乳腺癌CTCs檢測(cè)在診斷、治療、評(píng)估療效及提示預(yù)后等多方面具有重要的臨床意義。

3.1 乳腺癌診斷 CTCs檢測(cè)外周血標(biāo)本較易采集，故對(duì)部分病理類型及腫瘤基因型和表型特征不明的患者可利用對(duì)CTCs的檢測(cè)來協(xié)助診斷。血循環(huán)中檢測(cè)到CTCs并不意味著有轉(zhuǎn)移，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率會(huì)明顯增加。Reinholz等［9］研究用CTCs的分子生物學(xué)特征來早期診斷乳腺癌。無腫瘤病史，乳腺鉬鈀片發(fā)現(xiàn)乳腺異常而準(zhǔn)備行活檢術(shù)的患者，用密度梯度離心法和免疫磁性分離法聯(lián)合實(shí)時(shí)定量RT-PCR用于定量四種乳腺特異性基因：乳腺珠蛋白、GABA A(pi)、B305D-C和B726P的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)乳腺珠蛋白或B305D-C大于診斷標(biāo)準(zhǔn)的敏感度和特異性分別達(dá)到70.5%和81.0%。認(rèn)為用CTCs的分子生物學(xué)特征對(duì)乳腺浸潤性癌的早期診斷有潛在價(jià)值。Camara等［10］檢測(cè)手術(shù)前及術(shù)后30 min、60 min、3 d和7 d外周血中CTCs的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCs在術(shù)后30 min、60 min沒有變化，在術(shù)后3～4 d85%的患者升至原來的1 000倍。隨后CTCs出現(xiàn)下降，但58%的患者下降至手術(shù)前水平以上，直至開始術(shù)后輔助化療，在未予進(jìn)一步治療或僅給予內(nèi)分泌治療的低?；颊咧?，持續(xù)3年監(jiān)測(cè)CTCs水平發(fā)現(xiàn)數(shù)量多、持續(xù)升高或僅有輕度下降，提示該部分患者CTCs可能長期存在，這些CTCs可能持續(xù)處于休眠狀態(tài)，但可能在適宜條件下聚集并發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶。

3.2 用于化療療效及預(yù)后預(yù)測(cè)的意義 CTCs檢測(cè)的意義一般包括對(duì)新輔助化療、輔助化療的療效評(píng)估及長期的隨訪監(jiān)測(cè)。在一項(xiàng)研究中用CellSearch方法對(duì)118例新輔助治療的乳腺癌患者進(jìn)行CTCs檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，23%的患者在化療前已經(jīng)存在≥1個(gè)/7～5 ml外周血，在化療后此比例降到17%;提示CTCs可作為評(píng)價(jià)新輔助治療療效的早期指標(biāo)并且是代表PFS的一個(gè)預(yù)后因子，該方法已獲 FDA批準(zhǔn)用于臨床［11］。Xenidis等［12］用RT-PCR方法檢測(cè)437例乳腺癌患者輔助化療前后CK-19mRNA表達(dá)?；熐皺z測(cè)到CK-19mRNA的陽性細(xì)胞者與三個(gè)以上腋窩淋巴結(jié)陽性相關(guān)，輔助化療后仍為陽性的患者其復(fù)發(fā)和疾病死亡顯著增高，而無病生存和總生存顯著降低，因此認(rèn)為檢測(cè)到CK-19mRNA陽性CTCs是無病生存和總生存下降的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Ignatiadis等［13］在術(shù)后輔助治療前檢測(cè)444例臨床Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者的CTCs，總陽性率為40.8%，通過中位時(shí)間為53.5個(gè)月的隨訪，發(fā)現(xiàn)CTCs陽性組患者較CTCs陰性組患者易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，DFS顯著縮短。多因素分析提示CTCs是DFS和OS最有價(jià)值的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Tewes等［14］根據(jù)對(duì)32例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進(jìn)行治療療效分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在16例治療后CTCs陽性患者中，13例(81%)為疾病進(jìn)展，僅有3例(19%)達(dá)到部分緩解;在16例治療后CTCs陰性患者中，12例(75%)治療有效，4例(25%)疾病進(jìn)展，總計(jì)32例患者中25例的CTCs存在情況與治療效果相關(guān)，提示CTCs可預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的化療療效且預(yù)測(cè)率高達(dá)78%。另一項(xiàng)探討CTCs與FDG-PET/CT預(yù)后價(jià)值研究［15］發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)和進(jìn)展性乳腺癌患者中，骨轉(zhuǎn)移者出現(xiàn)較高的CTCs，且多發(fā)骨轉(zhuǎn)移較單發(fā)或兩個(gè)病灶CTCs數(shù)目要多。在多因素分析中，CTCs是OS的顯著預(yù)測(cè)指標(biāo)。

3.3 乳腺癌CTCs與個(gè)體化治療 在CTCs的研究領(lǐng)域，另一個(gè)令人感興趣的是內(nèi)分泌和分子靶向治療方案選擇［16］。目前仍主要考慮原發(fā)腫瘤組織的ER、PR和HER-2狀態(tài)，并未考慮CTCs。Xenidis等［17］對(duì)119例Ⅰ、Ⅱ期激素受體陽性的乳腺癌患者進(jìn)行研究，結(jié)果顯示5年他莫昔芬治療期間，在任意時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到CTCs陽性的患者PFS和OS均遠(yuǎn)短于任何時(shí)間均未檢測(cè)到CTCs的患者，提示CTCs的變化與內(nèi)分泌治療的敏感性及患者預(yù)后密切相關(guān)，輔助化療后體內(nèi)殘存有CTCs的患者，在5年他莫昔芬治療后，循環(huán)血中仍檢測(cè)到CTCs的患者比例高達(dá)68.2%，提示對(duì)化療耐藥的CTCs絕大部分對(duì)他莫昔芬也不敏感。Reuben等［18］報(bào)道2名原發(fā)腫瘤為ER陽性Her-2陰性但對(duì)常規(guī)內(nèi)分泌治療和化療無效的患者，在隨診中發(fā)現(xiàn)多部位轉(zhuǎn)移以及在一線治療前相對(duì)數(shù)目較多的CTCs，且CTCs存在Her-2基因轉(zhuǎn)錄。在給予兩周期多西他賽、卡鉑化療并聯(lián)合Trastuzumab治療后，患者癥狀減輕且PET/CT顯示客觀緩解。提示對(duì)于難治性乳腺癌，將CTCs的生物標(biāo)記物作為治療方案選擇的基礎(chǔ)有潛在可能性。

Meng等［19］檢測(cè)24例乳腺癌患者CTCs的HER-2基因擴(kuò)增情況，發(fā)現(xiàn)有9例(37%)患者雖原發(fā)腫瘤不表達(dá)HER-2，但是CTCs卻有HER-2的擴(kuò)增，提示在腫瘤進(jìn)展過程中CTCs可獲得HER-2擴(kuò)增。Meng等［19］發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤HER-2表達(dá)陰性而CTCs中HER-2表達(dá)陽性的患者仍可獲益于Herceptin治療。對(duì)9例原發(fā)腫物HER-2表達(dá)陰性，CTCs獲得HER-2基因擴(kuò)增患者中的4例予以Herceptin治療［20］，觀察發(fā)現(xiàn)3例治療有效，其中1例完全緩解、2例部分緩解。此外根據(jù)CTCs是否表達(dá)EGFR還可選擇是否應(yīng)用抗EGFR治療［21］，分析乳腺癌患者的CTCs有助于制定更為精確和個(gè)體化的治療方案，使更多的患者能接受并受益于內(nèi)分泌及分子靶向治療從而提高生存率。

3.4 乳腺癌 CTCs與腫瘤耐藥性 Gradilone等［22］證實(shí) CTCs多重耐藥相關(guān)蛋白(multidrug-resistance-related proteins，MRPs)與ALDH1表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。但ALDH1陽性與ALDH1陰性兩組患者PFS并差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示CTCs中的腫瘤干細(xì)胞具多重耐藥特性，這對(duì)于腫瘤細(xì)胞逃避藥物殺傷，繼續(xù)增殖可能是必要的，但也可能與系統(tǒng)治療后的選擇性有關(guān)［23］。

總之確定乳腺癌CTCs在臨床中是非常有意義的［24，25］，檢測(cè)CTCs有助于準(zhǔn)確判斷乳腺癌的預(yù)后［26］，并為評(píng)判和監(jiān)測(cè)化療療效提供依據(jù)，有利于患者的個(gè)體化治療，對(duì)于乳腺癌的研究前景有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。CTCs檢測(cè)在未來有望成為乳腺癌患者的臨床常規(guī)檢查。

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