基于全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景分析

陳惠 辛麗麗 龔婕寧

近年來，功能基因組學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛運用于動植物生理生化、腫瘤與干細(xì)胞、動植物分子育種及中醫(yī)藥研究等領(lǐng)域，并促進(jìn)了相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。功能基因組學(xué)研究包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)研究，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究是其中最為重要的一部分。在中醫(yī)藥研究中，隨著分子生物學(xué)前沿技術(shù)的大量應(yīng)用，人們已經(jīng)從多層次、多角度對中醫(yī)學(xué)的辨治理論及方藥的作用機制進(jìn)行了深入探討，取得了眾多令人矚目的研究成果。鑒于轉(zhuǎn)錄組學(xué)在功能基因組學(xué)中所處的重要地位，筆者認(rèn)為，將轉(zhuǎn)錄組學(xué)的新方法——全轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Sequence，RNA-Seq)技術(shù)應(yīng)用于中醫(yī)藥研究，可以促進(jìn)該領(lǐng)域的快速發(fā)展[1]。

近幾年，RNA-seq技術(shù)迅速發(fā)展，2012年美國推出了TotalScriptTMRNA-seq試劑盒，一個完整的轉(zhuǎn)錄組測序只需約5 ng的總RNA樣品(含有rRNA)且不需要片段化RNA[2]，甚至能完成單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組分析[3]。同年國內(nèi)華大基因也推出微量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(TruSeq)，從而實現(xiàn)了高效、穩(wěn)定的微量轉(zhuǎn)錄組測序。成熟的轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，尤其是新興的RNA-seq技術(shù)，以其整體性、系統(tǒng)性、個體組織差異性、時間獨立性等優(yōu)勢，可以更好的從基因水平闡明中醫(yī)學(xué)的辨治原理、方藥的作用機制等問題。尤其是該方法改善了以往單基因研究不能切合中醫(yī)學(xué)整體觀念的不足，因而是當(dāng)前中醫(yī)藥研究應(yīng)當(dāng)重視的重要方法。

1 RNA-seq技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組學(xué)中的優(yōu)勢

轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機理。轉(zhuǎn)錄組學(xué)提出之初采用的是基因芯片法，它利用固定探針與樣品(cDNA)進(jìn)行分子雜交，根據(jù)雜交圖譜熒光信息的強弱測定基因的表達(dá)豐度。該技術(shù)在過去幾年里以其操作簡便、快速和低廉的特點成為轉(zhuǎn)錄組分析的主導(dǎo)技術(shù)。但基于芯片技術(shù)只限用于已知基因序列,無法檢測新的RNA，也就無法應(yīng)用到還未完成全基因組測序和基因注釋的物種上；而且雜交技術(shù)靈敏度有限,不能很好地分辨基因序列同源性較高的基因家族和難以檢測低豐度的目標(biāo)及重復(fù)序列，更不能發(fā)現(xiàn)異常轉(zhuǎn)錄的基因。因此，在許多情況下不能滿足當(dāng)前研究的需要。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，RNA-seq技術(shù)開始逐步取代芯片技術(shù)。該技術(shù)首先將細(xì)胞中的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為cDNA文庫，然后將cDNA文庫中的DNA隨機剪切為小片段，在cDNA兩端加上接頭利用新一代高通量測序儀測序,直到獲得足夠的序列,所得序列通過比對或從頭組裝拼接，形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜；同時通過同已有的基因組序列比對得到基因轉(zhuǎn)錄后拼接和修飾的機制；也能通過基因序列出現(xiàn)的次數(shù)來檢測基因表達(dá)的豐度。

相比較芯片技術(shù)，RNA-seq技術(shù)采用數(shù)字化信號，靈敏度高，能檢測到低豐度表達(dá)的基因，檢測到單個堿基的差異和對RNA表達(dá)的定量化研究；測序成本比基因芯片低；不需要預(yù)先設(shè)計探針，適用于所有物種(包括沒有全基因組測序的)；而且測序結(jié)果得到的是完整的RNA序列[4]。因此，借此可以發(fā)現(xiàn)一些新基因和進(jìn)一步完成單個堿基水平和全基因組范圍的生物信息學(xué)分析和基因功能的研究。

2 RNA-seq技術(shù)在中醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.1 RNA-seq技術(shù)用于中醫(yī)辨治理論實質(zhì)的研究

辨證論治是中醫(yī)學(xué)的精髓，是臨床診治疾病的重要方法。雖然近年發(fā)展迅速的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)促進(jìn)了中醫(yī)學(xué)辨證客觀化的研究，使得中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)具有了一定的規(guī)范性和客觀性[5],但由于辨證主要依據(jù)病人的主觀感覺和醫(yī)生四診所得的臨床資料進(jìn)行綜合分析，缺乏深層次的客觀標(biāo)準(zhǔn)，所以“證”的確立與臨證醫(yī)家的思辨能力和診療水平密切相關(guān),很難做到真正意義上的客觀化和量化。運用現(xiàn)代研究技術(shù)手段對中醫(yī)“證候”的本質(zhì)進(jìn)行研究，已經(jīng)經(jīng)過了近60年的過程。在已有的報道中，有關(guān)“證候”實質(zhì)的轉(zhuǎn)錄組研究已有人作了初步的嘗試。例如，馬曉娟等[6]經(jīng)基因芯片分析和QRT-PCR驗證研究血瘀證患者差異基因表達(dá)譜,篩選出差異基因共有48個。嚴(yán)石林等[7]分析了不同疾病腎陽虛證的轉(zhuǎn)錄組特征，通過對差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway分析，找出332條共同差異表達(dá)基因，其中有注釋的基因為181條，探討了腎陽虛證“同證異治”的生物學(xué)基礎(chǔ)。這些差異表達(dá)的基因為中醫(yī)證候本質(zhì)的研究開啟了一扇大門。

在各種先進(jìn)診療設(shè)備趨于完善的今天，辨病施治可以提高醫(yī)生的診療速度與準(zhǔn)確度，輔助醫(yī)生處方用藥。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)尤其是芯片技術(shù)以其快速、高效、靈敏、經(jīng)濟等優(yōu)點已經(jīng)在疾病診斷上發(fā)揮了巨大作用。在西醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已大量運用于疾病的診斷。中南大學(xué)黃進(jìn)等[8]將分支DNA液相芯片技術(shù)應(yīng)用于胃癌相關(guān)基因表達(dá)的檢測，以用于評定化療療效。約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院朱教授對蛋白芯片技術(shù)的應(yīng)用做了回顧，并舉例說明蛋白芯片技術(shù)可以在基礎(chǔ)和臨床中廣泛應(yīng)用，并發(fā)揮巨大作用[9]?？梢?，芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病診斷中。

辨證論治與辨病施治是當(dāng)今臨床醫(yī)生診治疾病基本方法，其中辨證論治突顯中醫(yī)特色、辨病施治突顯西醫(yī)特色，中醫(yī)臨床大多強調(diào)辨證與辨病相結(jié)合。轉(zhuǎn)錄組學(xué)利用芯片技術(shù)在揭示“證”與“病”的實質(zhì)方面已經(jīng)取得了可喜的成就，但轉(zhuǎn)錄組學(xué)對中醫(yī)證候研究和疾病診斷上本身尚存在許多不足，如不能適應(yīng)基因表達(dá)的多態(tài)性、信息含量不夠全面、敏感性和準(zhǔn)確度不夠高等；加之芯片技術(shù)本身也存在一些局限性，一種芯片只能檢測有限的基因和診斷一種或幾種疾病，對于復(fù)雜證候則束手無策。因此，引入RNA-seq技術(shù)就十分必要。該技術(shù)能夠很好地解決這些問題，通過RNA-seq技術(shù)可以獲得不同病變組織、不同時間段的基因表達(dá)譜，分析表達(dá)譜從而找到一系列差異表達(dá)的基因，進(jìn)而結(jié)合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因的功能比對和構(gòu)建疾病影響的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[10]。也可進(jìn)一步挖掘不同個體病例的表達(dá)譜，結(jié)合人類基因組計劃，構(gòu)建一個病例與整體或組織器官特異表達(dá)譜相對應(yīng)的診斷數(shù)據(jù)庫，通過病人表達(dá)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中已建立的證型特異基因表達(dá)譜進(jìn)行生物信息學(xué)比較分析，初步對病人做出診斷[11]。所以，證候?qū)嵸|(zhì)的研究還有很多工作需要完善，首先是標(biāo)準(zhǔn)證型模型的建立，然后是相關(guān)證型數(shù)據(jù)庫的建立，可以設(shè)想，倘若中醫(yī)證型數(shù)據(jù)庫與疾病數(shù)據(jù)庫均足夠龐大，僅通過一次RNA-seq測序，就應(yīng)當(dāng)能做到對病人進(jìn)行疾病和證候的診斷，并為精確治療提供指導(dǎo)，從而大大提高臨床療效。

2.2 RNA-seq技術(shù)用于方藥有效成分的篩選和作用機制研究

中醫(yī)臨床治療疾病，以中藥復(fù)方為主要手段。實踐證明，大多數(shù)疾病的療效，是通過大量中藥有效成分來發(fā)揮作用的，因此不能通過傳統(tǒng)的單靶標(biāo)藥物篩選來研究中藥有效成分，而應(yīng)從多靶點的研究策略出發(fā)。長期以來，由于中藥復(fù)方成分過于復(fù)雜，為其機制研究帶來很大難度。芯片技術(shù)的應(yīng)用，為解決這一難題提供了新的手段，迄今已取得了一定成果。如劉喜德等[12]研究發(fā)現(xiàn)，溫化蠲痹湯干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠后，大鼠滑膜基因有222條差異表達(dá)，這些差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞凋亡、血管生成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。王東生等[13]構(gòu)建了大黃蟲丸治療動脈栓塞患者前后的基因表達(dá)譜，篩選出了血小板中243個差異基因。可見，芯片技術(shù)在方劑的研究上已經(jīng)突顯優(yōu)勢，鑒于RNA-seq技術(shù)在各方面更優(yōu)于芯片技術(shù)，因此，RNA-seq技術(shù)應(yīng)用于方劑研究可加快研究進(jìn)度與準(zhǔn)確度。利用RNA-seq技術(shù)建立不同方劑處理前后的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，通過比對現(xiàn)有的研究成果(如NCBI數(shù)據(jù)庫)，構(gòu)建藥物影響的代謝網(wǎng)絡(luò)通路，進(jìn)而解析方劑的作用機制，也許是該領(lǐng)域研究取得突破的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

幾千年的中醫(yī)藥學(xué)有其獨特的優(yōu)勢，但受到有效成分及作用機制不明確等因素影響而不能被西醫(yī)體系所普遍接受。因此，在中藥研究方面，篩選治療疾病的有效藥物并探討其作用機制歷來是其重要內(nèi)容。以腫瘤防治為例，從中藥中提取分離得到的抗腫瘤成分,包括三尖杉堿、紫杉醇、羥基喜樹堿和長春堿類等,已經(jīng)成為療效明確的抗腫瘤藥物[14]。目前，腫瘤防治的相關(guān)研究已從單純的細(xì)胞靶向殺滅逐步向腫瘤微環(huán)境方向轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，中醫(yī)藥在防治腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了較大作用。賀用和[15]總結(jié)了中藥和西藥在腫瘤轉(zhuǎn)移的應(yīng)用情況，并指出中藥治療相較西藥的手術(shù)、放化療等不良反應(yīng)少，且能減輕病人的痛苦而更易被患者所接受。孫大志[16]通過比較小鼠注射了MNK-45胃癌細(xì)胞間質(zhì)液和生理鹽水等對照的實驗，證實了中醫(yī)胃癌痰證理論和細(xì)胞間質(zhì)相關(guān)，從而說明化痰是抑制MNK-45胃癌轉(zhuǎn)移的重要方法。關(guān)于腫瘤轉(zhuǎn)移的研究，近幾年進(jìn)展迅速，繼種子與土壤學(xué)說之后，腫瘤干細(xì)胞與腫瘤轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換與腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤休眠與腫瘤遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)移逐步被提出，中醫(yī)藥在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面作用凸顯，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種抗腫瘤轉(zhuǎn)移中草藥，如白花蛇舌草、半枝蓮、人參、仙鶴草等。另外，很多學(xué)者對其機制也作了初步研究，王秀峰等[17-18]對近幾年中藥及其成分干預(yù)腫瘤轉(zhuǎn)移的研究報道進(jìn)行歸納總結(jié)，其中當(dāng)歸中提取的果膠多糖能夠增強機體B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；去甲斑蝥素通過下調(diào)橋粒核心糖蛋白，N-鈣黏蛋白，A、B連環(huán)蛋白的表達(dá)降低黏附；吳茱萸堿能夠通過抑制ERK的磷酸化來減少VEGF的表達(dá),抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等。鑒于中藥的有效成分及抗癌機制研究仍處在較初級階段，加快篩選有效抗癌中藥，并明確其有效成分及作用機制是需要努力的方向。在具體研究中，首先應(yīng)當(dāng)從一些有明確抗癌療效的臨床方藥入手來研究中藥抗癌機理和有效成分的篩選。而且，RNA-seq技術(shù)可以同其它一些分子生物學(xué)手段結(jié)合起來，通過構(gòu)建腫瘤對中藥應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄譜，找出差異表達(dá)的基因，從而架構(gòu)信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。選擇其中一些基因作為藥物篩選的maker基因，并結(jié)合熒光定量PCR (QRT-PCR)檢測maker基因的表達(dá)量，以之作為檢驗藥物有效性的標(biāo)準(zhǔn)。近來，隨著多能干細(xì)胞誘導(dǎo)(IPS)細(xì)胞體內(nèi)外誘導(dǎo)分化技術(shù)(該成果已在2012年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎)的成熟，為藥物篩選提供了充足的細(xì)胞材料[19]。選取病人的病變組織細(xì)胞，體外誘導(dǎo)成無限擴繁的IPS細(xì)胞系,以不同藥物組合處理這些細(xì)胞并獲得細(xì)胞的表達(dá)譜數(shù)據(jù)[20]，并以marker基因的表達(dá)情況為檢測標(biāo)準(zhǔn)篩選藥物的有效成分,然后在結(jié)構(gòu)生物學(xué)、藥物化學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的協(xié)同應(yīng)用下，以及采用現(xiàn)代藥物開發(fā)技術(shù)等，進(jìn)一步對這些有效成分進(jìn)行改造和組合，可以開發(fā)出更高效、更健康的抗腫瘤藥物。

2.3 RNA-seq技術(shù)用于臨床用藥安全評定體系的建立

純天然的中草藥并非是安全無毒的綠色藥物。在肯定中藥療效的同時，必須做好安全性評價體系，這是中醫(yī)藥走向現(xiàn)代化必備的基礎(chǔ)。由于中藥毒性的產(chǎn)生和其藥效的作用模式是相通的,因此其安全性檢測也必須強調(diào)系統(tǒng)化、動態(tài)化和整體化[21]。傳統(tǒng)中藥安全性評價主要采用一般化學(xué)藥物的研究思路，即著眼于有效成分(或毒性成分)進(jìn)行研究,存在著不可忽視的片面性，同時也沒有一個固定的標(biāo)準(zhǔn)化評定體系，使中藥的有效性和安全性受到一些質(zhì)疑。針對這一現(xiàn)狀，有專家指出在原有研究的基礎(chǔ)上，是否可以借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)做進(jìn)一步的深入研究，如通過相關(guān)RNA-seq數(shù)據(jù)的分析，檢測藥物是否引起了一些參與重要代謝途徑的蛋白的表達(dá)變化，根據(jù)表達(dá)量的變化來初步判定這些藥物是否具有潛在毒性,或把表達(dá)譜數(shù)據(jù)與有毒化合物的毒理效應(yīng)數(shù)據(jù)庫比對，觀察此類中藥是否含有這些毒性化學(xué)物質(zhì)并反應(yīng)其毒性的強弱程度[9]。因此，可以把RNA-seq表達(dá)譜作為臨床用藥安全評定的標(biāo)準(zhǔn)之一。

3 RNA-seq技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用策略分析

如上所述，RNA-seq技術(shù)數(shù)字化、系統(tǒng)化的特點在中醫(yī)藥研究中可以大展身手，但要使其發(fā)揮出更大的作用，尚應(yīng)當(dāng)重視以下關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

3.1 應(yīng)加強疾病及病證動物模型的研究

RNA-seq技術(shù)應(yīng)用于中醫(yī)藥研究離不開很好的病證動物模型。目前，一些疾病及中醫(yī)證候動物模型的建立及調(diào)控尚存在一定難度，并且如何將目的基因差異表達(dá)的程度和疾病時期、藥物劑量等聯(lián)系起來還不十分清楚，因此RNA-seq技術(shù)可先與病證動物模型研究相結(jié)合并把研究數(shù)據(jù)作為人類疾病診斷和治療的參考。目前已經(jīng)利用在組織結(jié)構(gòu)上、生理代謝上和人體有很大相似性的小鼠、大鼠、小型豬建立了多種疾病模型[22]，同時這些模式生物都已完成了全基因組測序、基因注釋，并在很多疾病上有了較好的分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)，但仍然缺乏公認(rèn)、成熟的病證結(jié)合模型。因此，加強對疾病和證候模型的研究，逐步建立和完善病證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，可為中醫(yī)臨床精確診斷、對癥下藥、同病異治奠定基礎(chǔ)。

3.2 應(yīng)加強對mRNA修飾和蛋白質(zhì)修飾的研究

目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析還只是停留在轉(zhuǎn)錄水平上?；蚪M中只有少部分基因表達(dá)成mRNA，大部分基因只是起調(diào)控作用，mRNA只是基因調(diào)節(jié)生命活動的中間體，更多的生命活動體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后的mRNA修飾和翻譯后的蛋白質(zhì)修飾上?，F(xiàn)有大量研究表明非編碼的RNA(ncRNA)起了重要調(diào)控作用，其中研究最熱的是microRNA(miRNA)。miRNA是22個左右核苷酸序列的小RNA，能夠靶向調(diào)控目標(biāo)基因[23]。鄭思道等[24]的一篇綜述很好地概括了miRNA在中醫(yī)藥研究中的進(jìn)展，miRNA參與了中藥有效成分對腫瘤的調(diào)控?，F(xiàn)有報道人類總共含有一千多個miRNA[25]，miRNA表達(dá)的特異性和時序性與中醫(yī)證候的動態(tài)時空特征極其相似，如王階等[26]提出將miRNA引入冠心病中醫(yī)證候的研究，借助miRNA芯片及生物信息學(xué)技術(shù)，建立和證候相關(guān)的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為從轉(zhuǎn)錄水平研究中醫(yī)藥提供了新的視角。隨著RNA-seq技術(shù)的發(fā)展還會發(fā)現(xiàn)更多參與疾病調(diào)控的microRNA，并闡述其調(diào)控的分子機制。另外，蛋白質(zhì)才是生命活動真正的體現(xiàn)者，有很多蛋白功能都是在翻譯后調(diào)控的，如甲基化、糖基化和磷酸化/去磷酸化等修飾作用，其RNA轉(zhuǎn)錄量并沒有任何改變。因此，充分利用RNA-seq技術(shù)，加強對mRNA修飾和蛋白質(zhì)修飾的研究，促進(jìn)基因組學(xué)加深對功能基因和調(diào)控基因功能和結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，進(jìn)一步豐富各種蛋白質(zhì)、次生代謝物的數(shù)據(jù)庫，可以幫助人們在蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)水平上更深層次地研究中醫(yī)藥學(xué)。

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