烏梅丸對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠脾臟組織Bcl-2表達(dá)的影響

吳 霽，柯琴梅，范 恒

(1 南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南昌 330000;2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院)

T細(xì)胞的凋亡抑制在結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中起重要作用。T細(xì)胞凋亡受抑，體內(nèi)T細(xì)胞將過(guò)度活化與增殖，并分泌炎性因子如 IL-4、IL-5、IL-13、TGF-β等，導(dǎo)致腸道炎癥發(fā)生。脾臟是免疫細(xì)胞尤其是T細(xì)胞居住的場(chǎng)所，也是細(xì)胞免疫應(yīng)答產(chǎn)生的重要場(chǎng)所，研究表明，脾臟T細(xì)胞數(shù)目及功能與機(jī)體免疫反應(yīng)呈正相關(guān)［1，2］。目前，關(guān)于脾臟組織 T細(xì)胞的凋亡抑制在結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的作用尚不十分清楚。2011年5～11月，我們觀察了烏梅丸對(duì)2，4，6-三硝基苯璜酸(TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠脾臟組織抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，旨在探討烏梅丸治療結(jié)腸炎的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量200～250 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組、美沙拉嗪組、烏梅丸組各14只，飼養(yǎng)于濕度50% ～70%、溫度20℃的動(dòng)物房?jī)?nèi)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作方法 除空白對(duì)照組外，其他三組均在禁食不禁飲24 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，導(dǎo)尿管緩緩插入肛門8 cm，注入50%乙醇溶液0.25 mL，繼之注入 5% 的 TNBS 溶液 0.3 mL，將大鼠提尾倒置30 s，使藥液緩慢進(jìn)入腸道。大鼠清醒后自由飲食、進(jìn)水，觀察其精神狀態(tài)、大便顏色和形狀、皮毛等變化。

1.2.2 藥物干預(yù)方法 烏梅丸藥液制備:烏梅16 g、細(xì)辛 6 g、干姜 10 g、黃連 16 g、當(dāng)歸 4 g、附子6 g、蜀椒 4 g、桂枝 6 g、生曬參 6 g、黃柏 6 g，按傳統(tǒng)方法配制成含生藥濃度0.515 g/L的水煎劑。美沙拉嗪混懸液制備:取44 g美沙拉嗪用研缽研細(xì)，過(guò)100目篩，研磨，配成50 kg/L的混懸液。模型建成2 d后，美沙拉嗪組用美沙拉嗪混懸液3 mL/d灌胃，烏梅丸組用烏梅丸藥液3 mL/d灌胃，空白對(duì)照組和結(jié)腸炎模型組用蒸餾水3 mL/d灌胃，連續(xù)15 d。排除死亡大鼠，每組最后各剩10只。第16天大鼠禁食不禁水24 h后處死，取脾臟，每個(gè)脾臟分為2份，裝于EP管中，液氮冰凍保存。

1.2.3 Real time-PCR 方法檢測(cè) Bcl-2 mRNA 表達(dá)使用RNA提取試劑盒提取脾臟組織的RNA，分光光度計(jì)測(cè)量 RNA濃度，取5 μL模板 RNA、Oligo(dT)15(10 μmol/L)2 μL、ddH2O(Rnase free)6 μL混勻，放入PCR儀中，70℃ 5 min，立即置于冰上1 min，然后瞬時(shí)離心并加入以下試劑:5×RT buffer 4 μL、HRP(RRI)/RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MLV 0.5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，總體積為 20 μL 的反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄條件:42℃ 30 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。引物序列:Bcl-2引物上游:5'-GGTGGTGGAGGAACTCTTCA-3'，下游:5'-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度157 bp，退火溫度58℃;內(nèi)參 β-actin引物上游:5'-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3'，下游:5'-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度265 bp，退火溫度55.7℃。擴(kuò)增條件:95℃ 60 s預(yù)變性;95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，對(duì)Bcl-2的產(chǎn)物相對(duì)定量，讀取CT值，使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.4 Western-blot檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá) 各組取脾臟組織250～500 mg剪碎，加入裂解液，勻漿抽提總蛋白，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取70 μg總蛋白上樣凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉，依次加入一抗和二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST充分洗滌，顯色曝光，結(jié)果用光密度掃描灰度值分析(采用凝膠成像系統(tǒng)分析)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以表示，多組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸組織病理改變 結(jié)腸炎模型組中固有層和黏膜層內(nèi)可見彌漫性中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)腸黏膜腺體排列紊亂，杯狀細(xì)胞減少。正常結(jié)腸組織黏膜和固有層結(jié)構(gòu)完整，腺體排列較整齊。烏梅丸組和美沙拉嗪組淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組減輕，黏膜及固有層結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，杯狀細(xì)胞較模型組多，腺體排列相對(duì)整齊。

2.2 各組脾臟組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)比較 空白對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組、美沙拉嗪組、烏梅丸組的Bcl-2 mRNA 表達(dá)相對(duì)量分別為1.06 ±0.04、2.48 ±0.43、1.56 ± 0.09、1.57 ± 0.15。與空白對(duì)照組相比，結(jié)腸炎模型組 Bcl-2 mRNA表達(dá)升高(P＜0.05);與結(jié)腸炎模型組相比，烏梅丸組、美沙拉嗪組表達(dá)下降(P均＜0.05);烏梅丸組和美沙拉嗪組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.3 各組脾臟組織中Bcl-2蛋白表達(dá)比較 空白對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組、美沙拉嗪組、烏梅丸組的Bcl-2 蛋白表達(dá)量分別為 0.76 ±0.10、1.26 ±0.20、0.96 ±0.16、0.93 ±0.11。與空白對(duì)照組相比，結(jié)腸炎模型組Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P＜0.05);與結(jié)腸炎模型組相比，烏梅丸組、美沙拉嗪組表達(dá)下降(P＜0.05);烏梅丸組和美沙拉嗪組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。

3 討論

結(jié)腸炎的病因與遺傳、感染、環(huán)境、免疫等因素相關(guān)，是多因素相互作用的結(jié)果。正常情況下，機(jī)體一方面通過(guò)T細(xì)胞活化增殖去除抗原，另一方面通過(guò)T細(xì)胞凋亡抑制T細(xì)胞過(guò)度產(chǎn)生和活化，從而使腸黏膜內(nèi)免疫系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)。若T細(xì)胞凋亡受抑，體內(nèi)T細(xì)胞將過(guò)度活化與增殖，并分泌炎性因子如 IL-4、IL-5、IL-13、TGF-β 等［3］，導(dǎo)致腸道炎癥發(fā)生。研究提示，潰瘍性結(jié)腸炎抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比例升高，T細(xì)胞凋亡受到抑制［4］，表明T細(xì)胞的凋亡抑制在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制起重要作用。脾臟是細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所，脾臟T細(xì)胞數(shù)目及功能與機(jī)體免疫反應(yīng)呈正相關(guān)。

烏梅丸出自張仲景《傷寒論·厥陰病篇》，其組方中的烏梅酸斂收固，附子、干姜、桂枝扶陽(yáng)以勝寒，蜀椒、細(xì)辛通陽(yáng)以破陰。黃連、黃柏苦寒以堅(jiān)其陰，清以瀉熱，黨參、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血。諸藥合用，使寒熱邪去，陰陽(yáng)協(xié)調(diào)，氣血恢復(fù)。全方酸收熄風(fēng)，辛熱助陽(yáng)，酸苦堅(jiān)陰，寒熱溫涼，溫清斂補(bǔ)，攻補(bǔ)兼施，諸藥配伍，調(diào)理陰陽(yáng)寒熱虛實(shí)，使之歸復(fù)于平和。臨床研究表明，烏梅丸治療潰瘍性結(jié)腸炎有顯著療效［5］。Fan 等［6］研究顯示，烏梅丸可下調(diào) NF-κB，減少腸道炎癥因子 TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10 釋放，減輕腸道炎癥損傷。美沙拉嗪屬柳氮磺胺吡啶類藥物，常用于炎癥性腸病的治療，可抑制前列腺素的合成和炎性介質(zhì)白三烯形成，顯著抑制腸黏膜的炎癥反應(yīng)。

本研究觀察了烏梅丸對(duì)結(jié)腸炎大鼠脾臟組織T細(xì)胞抗凋亡蛋白及T細(xì)胞凋亡抑制的影響，結(jié)果顯示，與結(jié)腸炎模型組比較，烏梅丸組黏膜及固有層結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，腺體排列相對(duì)整齊，杯狀細(xì)胞多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕;與空白對(duì)照組相比，結(jié)腸炎模型組Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)升高;與結(jié)腸炎模型組相比，烏梅丸組、美沙拉嗪組Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)下降，而烏梅丸組和美沙拉嗪組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示烏梅丸可能通過(guò)下調(diào)脾臟組織Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)，增加脾臟組織T細(xì)胞的凋亡，減少T細(xì)胞分泌炎癥因子，從而減輕結(jié)腸黏膜的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療結(jié)腸炎的作用。

目前，關(guān)于哪些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與下調(diào)脾臟組織Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)，使T細(xì)胞凋亡受抑尚不清楚。有研究表明，細(xì)胞核內(nèi)的β-arrestin 1可募集組蛋白乙酰化酶p300至Bcl-2基因的啟動(dòng)子，使編碼基因Bcl-2的啟動(dòng)子序列區(qū)域組蛋白H4乙?；饔迷鰪?qiáng)，導(dǎo)致 Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn) Bcl-2表達(dá)［7～9］。Bcl-2 表達(dá)增加，Bcl-2/Bax 比例升高，抗凋亡信號(hào)相對(duì)增強(qiáng)，抑制細(xì)胞質(zhì)線粒體釋放細(xì)胞色素C和caspase活化過(guò)程［10］，可抑制T細(xì)胞凋亡。烏梅丸是否通過(guò)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)脾臟組織Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。研制以T細(xì)胞為靶向的單克隆抗體或其他藥物，以降低T細(xì)胞的數(shù)目和反應(yīng)性，可望為結(jié)腸炎的治療提供更好的方法。

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