Wnt蛋白分泌機(jī)制的研究進(jìn)展

李鳳立 靳衛(wèi)國

( 1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬聊城醫(yī)院，山東 聊城 252000)

人類疾病的發(fā)生發(fā)展是多因素、多環(huán)節(jié)共同參與的復(fù)雜過程，其中涉及多條復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。近年來，關(guān)于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究越來越受到人們的重視。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是人體內(nèi)一條極為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與胚胎發(fā)育密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞的生長、增殖、分化及凋亡等生物學(xué)行為具有重要的調(diào)控作用。Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育和分化的多個(gè)重要環(huán)節(jié)，在正常情況下對(duì)胚胎發(fā)育和成人的部分組織形成和功能發(fā)揮起著重要作用，而當(dāng)該途徑紊亂異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。隨著對(duì)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究逐漸深入，現(xiàn)比較明確的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的靶基因包括細(xì)胞增殖調(diào)控基因、發(fā)育控制基因和與腫瘤發(fā)生相關(guān)基因，如在細(xì)胞周期中能加速G1/S期進(jìn)程的c-myc、cyclin D1及抗細(xì)胞凋亡的基因survivin 等。Wnt信號(hào)通路紊亂與眾多人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，目前有十幾種目前已知的高發(fā)性癌變都源于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的失調(diào)[1-4]。

1 Wnt信號(hào)通路的組成

Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至少存在下列路徑:經(jīng)典的Wnt/beta-catenin通路;非經(jīng)典的Wnt通路、Wnt/Ca2+和Wnt/PCP等途徑[5-6]。Wnt/β-catenin信號(hào)途徑是已發(fā)現(xiàn)三條Wnt信號(hào)途徑中研究最深入的部分，它的主要組分包括Wnt蛋白，卷曲蛋白(Frz)，散亂蛋白(Dvl或Dsh)，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)，結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)，軸蛋白(Axin)，酪蛋白激酶 (CKI)，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(TCF/LEF)等。在正常成熟細(xì)胞中無Wnt信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，GSK-3β與胞內(nèi)的APC、Axin、CKI、β-catenin形成多聚蛋白降解復(fù)合體降解β-catenin，阻斷了其對(duì)下游靶基因的激活。當(dāng)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號(hào)配體Wnt蛋白結(jié)合膜受體Frz，并激活胞漿內(nèi)的Dsh，而磷酸化GSK-3β，使其從降解復(fù)合體脫落，因而β-catenin不能正常降解而在胞漿內(nèi)異常聚集，大量游離的β-catenin進(jìn)入核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合而導(dǎo)致wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。在這些成員中，Wnt 蛋白與Fz 的結(jié)合對(duì)整個(gè)通路起開關(guān)作用；β-catenin 則是該通路的一個(gè)關(guān)鍵成分子[7]。

過去的幾十年，關(guān)于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究主要集中在兩個(gè)方面:(1)各種Wnt通路在靶細(xì)胞中的傳遞過程；(2)Wnt通路對(duì)靶細(xì)胞發(fā)育、分化即目標(biāo)基因的激活表達(dá)過程的影響。然而，關(guān)于在該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中類似開關(guān)作用的即有活性的Wnt蛋白在分泌細(xì)胞中是如何合成并被運(yùn)輸?shù)桨獍l(fā)揮作用的，在這個(gè)過程中Wnt蛋白是如何被賦予功能和發(fā)揮作用的等等，針對(duì)這方面的研究國內(nèi)外均較少[8]。

2 Wnt蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

Wnt是由最早發(fā)現(xiàn)的2個(gè)基因組合而來的,即果蠅wngless(wg)基因及小鼠Int-1基因。從線蟲到人類都有Wnt基因，現(xiàn)已克隆出19種Wnt基因家族的成員。Wnt蛋白是由350～400個(gè)氨基酸組成的分泌型糖蛋白，其蛋白序列高度保守且具有共同的特征。首先，都含有23個(gè)左右的高度保守的半胱氨酸(Cys)殘基位點(diǎn)，這些Cys殘基之間可以形成二硫鍵，指揮著Wnt 蛋白的正確折疊和運(yùn)輸。其次，Wnt蛋白都在特定位點(diǎn)被脂質(zhì)化修飾和N-糖基化修飾，這些修飾直接影響著Wnt蛋白的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。Willert等在轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3a基因的小鼠L細(xì)胞培養(yǎng)基中純化小鼠Wnt3a時(shí)發(fā)現(xiàn)了另一種翻譯后修飾方法，即N-末端的77位半胱氨酸被棕櫚酰化(C77A)；Zhai 等也發(fā)現(xiàn)Wg被脂化修飾了；其中高度保守的半胱氨酸提示棕櫚?；赡苁荳nt的基本特點(diǎn)。盡管它們的控制機(jī)制并沒有完全闡明，但研究已證明，這些修飾位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生突變后，Wnt蛋白不能分泌出胞，只能積累在胞內(nèi)[9-10]。Wnt蛋白與相應(yīng)受體的結(jié)合活化使Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得以開啟。Wnt蛋白是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、發(fā)育和分化的分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌激活不同的Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在靶細(xì)胞中發(fā)揮作用。但它的合成、成熟、運(yùn)輸及分泌是一個(gè)復(fù)雜的、高度監(jiān)管的過程[11]。

3 Wnt蛋白的合成、成熟、運(yùn)輸及分泌

Belenkaya[12]研究表明wntless和retromer復(fù)合體在Wnt蛋白分泌中起關(guān)鍵作用。Wnt蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成并修飾后，被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中，與高爾基體膜上的wntless組成復(fù)合物，一起被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上并釋放到胞外，而wntless通過某種途徑內(nèi)陷回收進(jìn)入胞內(nèi)。此時(shí)retromer復(fù)合體能夠識(shí)別內(nèi)吞的wntless，并把它回收到高爾基體中繼續(xù)發(fā)揮作用，防止其通過溶酶體途徑被降解[13]。

另外，Hausmann等[10]和Michaux等[11]研究也都提示wntless是Wnt蛋白分泌所必需的，且通過體內(nèi)外基因干擾wntless實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)wntless對(duì)其他蛋白質(zhì)的分泌沒有明顯影響，如Hh。wntless在線蟲和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的高度保守性，以及在表達(dá)wnt蛋白的器官中wntless的保守性表達(dá)和wntless與Wnt蛋白綁定模式，均表明wntless是Wnt蛋白的忠實(shí)伴侶。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也顯示wntless和Wnt蛋白相互聯(lián)系在一起[14]，也支持以上觀點(diǎn)。在wntless突變型的果蠅中，wnt蛋白積累在胞內(nèi)不能分泌出胞，Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游信號(hào)通路的靶基因激活也被阻斷，而其它的信號(hào)蛋白分子卻不受影響，因此不難推測(cè)wntless能特異性協(xié)助Wnt蛋白分泌出胞。雖然wntless的作用機(jī)制目前還未闡明，但多數(shù)研究結(jié)果均提示它可能作為一種分選受體，特異性的協(xié)助Wnt蛋白從高爾基體運(yùn)輸?shù)桨?，或者還可能發(fā)揮修飾酶或分子伴侶的作用，協(xié)助wnt蛋白進(jìn)行正確的折疊加工。而Wnt蛋白的某些修飾可能影響wntless對(duì)其的分選識(shí)別，影響Wnt蛋白的自分泌和旁分泌，調(diào)控Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。wntless的回收或降解對(duì)Wnt蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌也是很重要的，但這種分選受體的平衡又依賴于胞內(nèi)的retromer復(fù)合體的調(diào)控[5]。

Retromer復(fù)合物是一個(gè)多亞基組成的復(fù)合物，在哺乳動(dòng)物中由分選亞基(VPs35、VPs29、VPs26)和錨接亞基(SNX1和SNX2)組成，它負(fù)責(zé)細(xì)胞中許多蛋白的運(yùn)輸與回收[16]。在wntless作用被發(fā)現(xiàn)的同時(shí)，另外有兩個(gè)著名的實(shí)驗(yàn)室也證實(shí)retromer復(fù)合體也是Wnt蛋白分泌所必需。retromer復(fù)合體的關(guān)鍵亞基vps35突變后，Wnt 蛋白分泌出現(xiàn)障礙，并且這種效應(yīng)具有特異性。由于功能類似，可以推測(cè)在Wnt 蛋白的分泌過程中wntless和retromer復(fù)合體可能一起發(fā)揮作用。Franch-Marro等研究證實(shí)，Retromer復(fù)合體能夠分選回收wntless。wntless協(xié)助Wnt蛋白分泌出胞后，通過細(xì)胞內(nèi)吞作用使其回收入細(xì)胞內(nèi)核內(nèi)體，這時(shí)Retromer復(fù)合體通過其分選亞基識(shí)別wntless，將wntless從核內(nèi)體中逆向運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中，防止它經(jīng)溶酶體途徑被降解[17]。因此，可以推測(cè)Wnt 蛋白、wntless和retromer復(fù)合體形成的一個(gè)動(dòng)態(tài)循環(huán)的模式：wntless協(xié)助Wnt 蛋白的分泌，retromer復(fù)合體分選回收wntless使其處于動(dòng)態(tài)平衡中，共同保證著Wnt蛋白的正常分泌。在某種意義上考慮，控制或打破這個(gè)動(dòng)態(tài)循環(huán)的平衡可以干擾wnt蛋白的功能性分泌，調(diào)控Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在靶細(xì)胞的作用。

鑒于基因干擾技術(shù)的成熟及廣泛應(yīng)用，我們可以通過該技術(shù)進(jìn)一步研究調(diào)控Wnt 蛋白分泌的眾多因素和復(fù)雜機(jī)制。Bugarcic等[18]研究提示retromer復(fù)合體在分泌Wnt蛋白的細(xì)胞中對(duì)wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞事件中也起著關(guān)鍵作用，尤其是對(duì)Wnt 蛋白的旁分泌。retromer復(fù)合體的亞基與TBC1D5和GOLPH3蛋白連接，在蛋白質(zhì)從高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)中發(fā)揮作用。有學(xué)者進(jìn)一步研究表明在DC細(xì)胞中由于Vps35能回收核內(nèi)體的wntless，使其返回高爾基體重新發(fā)揮協(xié)助Wnt蛋白出胞的作用，所以它參與Wnt蛋白分泌的過程是通過wntless間接發(fā)揮作用的；而且雖然VPs35被干擾，它只能影響wntless的回收，而新的wntless分子會(huì)不斷的合成，因此wntless對(duì)Wnt分泌的影響作用更直接更明顯[8，15]。Coudreuse等[19]研究支也持此觀點(diǎn)，他們通過對(duì)HEK細(xì)胞中VPS35基因敲除的研究，發(fā)現(xiàn)wnt3A的分泌無明顯變化。

4 Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑研究

隨著對(duì)Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的深度研究，針對(duì)信號(hào)通路的各個(gè)層面分子的抑制劑也日益出現(xiàn)。經(jīng)典Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受體抑制劑由分泌蛋白sFRP家族(the secreted Frizzled-related family)和Dkk家族(the Dickkopf family) 構(gòu)成, 通過結(jié)合Wnt 分子和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合輔助受體LRP5/6，從而有效抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi), 發(fā)揮抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的作用。其中sFRP家族包括sFRP、WIF-1、Cerberus和WISE，同時(shí)抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和非經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路。而DKK家族只抑制經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路[20]。針對(duì)Wnt 蛋白合成分泌方面的抑制作用研究較少，可能是Wnt蛋白的很多生化特性有很多謎團(tuán)未解決。與其它信號(hào)分子不同，如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，Wnt 蛋白還不能進(jìn)行大量的生產(chǎn)，廣泛研究、分析等。還有Wnt 蛋白復(fù)雜的翻譯后修飾和一系列高度特異性和研究較少的加工酶的修飾處理使得Wnt 蛋白結(jié)構(gòu)功能的研究更加困難。隨著第一個(gè)Wnt蛋白結(jié)構(gòu)研究清楚后，更多的研究將焦點(diǎn)集中到Wnt 蛋白上，從Wnt 蛋白的合成到成熟、功能性分泌及介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生的復(fù)雜效應(yīng)等過程正逐漸清晰[21]。如目前已證實(shí)Wnt 信號(hào)的激活必須Porcupine(Pro)參與，Pro對(duì)Wnt蛋白進(jìn)行?；⑺鼈冨^釘?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上以刺激它們的轉(zhuǎn)錄后N-糖基化修飾，此過程對(duì)Wnt 蛋白的分泌是必需的[22]。

5 結(jié) 語

從已有的研究來看，經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的啟動(dòng)蛋白即Wnt蛋白的合成分泌涉及多種相關(guān)因子之間相互作用，有多種復(fù)雜的機(jī)制參與促進(jìn)其成熟及其有功能的分泌。對(duì)目前已發(fā)現(xiàn)的重要相關(guān)因子如wntless和retromer復(fù)合體等的具體作用機(jī)制并未完全闡明，而且可能還有未發(fā)現(xiàn)的相關(guān)因子在其中產(chǎn)生作用。從Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的開關(guān)環(huán)節(jié)進(jìn)行分析，對(duì)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行更加深入的研究。對(duì)wnt蛋白質(zhì)的合成、成熟和功能性分泌進(jìn)行研究，以尋求在這一系列過程中通過外界因素如酶學(xué)修飾、藥物抑制、基因沉默等干擾因素影響Wnt 蛋白的脂化、棕櫚?；疤腔揎椈蚋蓴_其定位、轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等，進(jìn)而調(diào)控信號(hào)通路在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用，為今后人類腫瘤針對(duì)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路開發(fā)新的腫瘤治療藥物提供更多的參考依據(jù)。

[1] Zimmerman Z F, Moon R T, Chien A J. Targeting Wnt Pathways in Disease[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012，35(10)：158-163.

[2] 王芳, 潘曉琳, 李鋒. Wnt/β-catenin通路異常在卵巢癌中的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)墾醫(yī)學(xué), 2010,20(5):455-457.

[3] 劉向東,萬瑩鏵. Wnt信號(hào)傳導(dǎo)與腫瘤[J]. 癌癥進(jìn)展, 2009,18(3):296-300.

[4] 莊瑜, 劉俊, 肖明第. Wnt蛋白:從合成到分泌[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009,10(14):2769-2772.

[5] Lorenowicz MJ, Korswagen H C. Sailing with the Wnt: charting the Wnt processing and secretion route[J]. Exp Cell Res, 2009, 315(16):2683-2689.

[6] Widelitz R. Wnt signaling through canonical and non-canonical pathways: recent progress[J]. Growth Factors, 2005, 23(2):111-116.

[7] Kikuchi A, Yamamoto H, Sato A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways[J]. Trends Cell Biol, 2009, 19(3):119-129.

[8] 郭陳智. 人樹突狀細(xì)胞中WNT蛋白分泌機(jī)制的初步研究[D]. 華東師范大學(xué), 2010.

[9] Tang X, Wu Y, Belenkaya T Y, et al. Roles of N-glycosylation and lipidation in Wg secretion and signaling[J]. Dev Biol, 2012, 364(1):32-41.

[10] Hausmann G, Banziger C, Basler K. Helping Wingless take flight: how WNT proteins are secreted[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(4):331-336.

[11] Michaux G, Le Borgne R. Sorting, recycling and WNT signaling: Wntless and retromer functions[J]. Med Sci (Paris), 2009, 25(6-7):617-621.

[12] Belenkaya T Y, Wu Y, Tang X, et al. The retromer complex influences Wnt secretion by recycling wntless from endosomes to the trans-Golgi network[J]. Dev Cell, 2008, 14(1):120-131.

[13] Port F, Kuster M, Herr P, et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless[J]. Nat Cell Biol, 2008, 10(2):178-185.

[14] Gasnereau I, Herr P, Chia P Z, et al. Identification of an endocytosis motif in an intracellular loop of Wntless protein, essential for its recycling and the control of Wnt protein signaling[J]. J Biol Chem, 2011, 286(50):43324-43333.

[15] Zhang P, Wu Y, Belenkaya T Y, et al. SNX3 controls Wingless/Wnt secretion through regulating retromer-dependent recycling of Wntless[J]. Cell Res, 2011, 21(12):1677-1690.

[16] Seaman M N, Harbour M E, Tattersall D, et al. Membrane recruitment of the cargo-selective retromer subcomplex is catalysed by the small GTPase Rab7 and inhibited by the Rab-GAP TBC1D5[J]. J Cell Sci, 2009, 122(Pt 14):2371-2382.

[17] Franch-Marro X, Wendler F, Guidato S, et al. Wingless secretion requires endosome-to-Golgi retrieval of Wntless/Evi/Sprinter by the retromer complex[J]. Nat Cell Biol, 2008, 10(2):170-177.

[18] Bugarcic A, Zhe Y, Kerr M C, et al. Vps26A and Vps26B subunits define distinct retromer complexes[J]. Traffic, 2011, 12(12):1759-1773.

[19] Coudreuse D Y, Roel G, Betist M C, et al. Wnt gradient formation requires retromer function in Wnt-producing cells[J]. Science, 2006, 312(5775):921-924.

[20] Yeh J R. A Wnt inhibitor with a twist[J]. Chem Biol, 2011,18(12):1518-1520.

[21] Willert K，Nusse R. Wnt proteins[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012，4(9)：235-240.

[22] Komekado H, Yamamoto H, Chiba T, et al. Glycosylation and palmitoylation of Wnt-3a are coupled to produce an active form of Wnt-3a[J]. Genes Cells, 2007，12(4):521-534.