重組人血管內(nèi)皮抑素對放射增敏作用的研究

張蓓蓓綜述 高春玲審校

血管生成，是從現(xiàn)有的血管形成新的毛細血管，參與了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［1］。當腫瘤大小超過 1 ～2 mm3［2］時，血管生成就成為腫瘤進展必不可少的過程［3-7］。Folkman等［2］首次提出，當腫瘤體積＞1 mm3，腫瘤生長所需的養(yǎng)料和氧以及代謝廢料的運出必須通過形成新血管，只靠擴散作用是不行的。如果沒有生成新的血管，大部分腫瘤將停止生長，處于休眠狀態(tài)，腫瘤的直徑不超過2～3 mm［8］。還有實驗發(fā)現(xiàn):將包含 bFGF的緩釋聚合物種植在眼睛的虹膜上，會誘導新生血管的形成，當除去這個聚合物時，血管在2～3周內(nèi)消退了。這個實驗顯示，在每個組織中都有靜止的血管分布，腫瘤必須不斷刺激新的血管生成，這種刺激必須大于血管靜止水平，以便維持新生血管的生長。否則新生的血管會消退到靜止狀態(tài)。因此，抑制腫瘤血管生成，促使腫瘤細胞進入休眠狀態(tài)或誘發(fā)凋亡是治療腫瘤的有效途徑之一。第一個應用于癌癥的血管生成抑制劑已被FDA批準，其中應用最廣泛和毒性最小的2種血管生成抑制劑是Caplostatin和Endostatin.Endostatin是一組內(nèi)源性抗血管生成蛋白的一個成員，對血管生成的抑制是多方面的。最近研究顯示，Endostatin不僅有抑制血管內(nèi)皮細胞的功能，還有直接抗腫瘤作用。

放射治療是許多人類癌癥的重要治療方法，但往往是不成功的，因為腫瘤細胞的抵抗作用［9-10］?？鼓[瘤血管的治療對血管的作用將直接影響腫瘤的氧分壓，從而影響放療的敏感性，現(xiàn)在聯(lián)合Endostatin與放療的治療成為腫瘤綜合治療的研究熱點。現(xiàn)對其研究現(xiàn)狀介紹如下。

1 Endosatin的生物學特征

1.1 分子特性

Endostatin是一個分子量為20 kD的膠原蛋白XVⅢC末端的氨基酸片段，包括一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)和β一片層。在Endostatin分子中，有42%的疏水性氨基酸殘基。而且在Endostatin的表面，有對肝素高度親和力的精氨酸殘基。人源的Endostatin和鼠源的Endostatin有很高的同源性，兩者的氨基酸殘基大部分完全一致，約占86%。但是，人源的Endostatin與鼠源的 Endostatin相對比，人源的 Endostatin C端多了一個賴氨酸殘基［11］，N端比鼠源的Endostatin少了12個殘基。

1.2 肝素結(jié)合位點

在Endostatin的分子中，有一個與肝素親和力很高的堿性區(qū)域，這個堿性區(qū)域由11個精氨酸殘基構(gòu)成，也是Endostatin發(fā)揮作用的關(guān)鍵區(qū)域。Yamaguchi等［12］研究發(fā)現(xiàn)，如果Endostatin的濃度較低時，肝素結(jié)合位點對Endostatin的作用沒有影響，當Endostatin的濃度增加到一定程度時，肝素結(jié)合位點就成了主要的作用位點，影響到Endostatin的作用。Fu等［13］研究提示:Endostatin分子中的的疏松結(jié)構(gòu)和肝素結(jié)合位點結(jié)合后將更利于Endostatin發(fā)揮它的生物學作用。

1.3 Zn2+結(jié)合位點

Ding等［14］通過結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Endostatin存在一個Zn2+結(jié)合位點，由 His1、His2、His11 、Asp207 組成。Boehm 等［15］曾研究認為該位點是Endostatin抗血管生成的基本要素，但后來多項研究表明，此位點只與Endostatin的結(jié)構(gòu)性有關(guān)而與其功能性無關(guān)。

2 Endostatin的作用機制

Endostatin的作用機制有:①抑制內(nèi)皮細胞的增殖，Endostatin特異性地針對新生血管生成，一個很重要的發(fā)現(xiàn)即Nucleolin在欲增殖的人類微血管內(nèi)皮細胞的表面表達，而不在靜止的內(nèi)皮細胞的表面表達。這細胞表面的nucleolin可以結(jié)合Endostatin并把它轉(zhuǎn)運到細胞核，在那里Endostatin抑制nucleolin的磷酸化。Nucleolin的磷酸化是內(nèi)皮細胞增殖的關(guān)鍵。因此，Endostatin對靜止的內(nèi)皮細胞沒有增殖抑制的作用，對非血管內(nèi)皮細胞系細胞、平滑肌細胞等也沒有增殖抑制作用［16］;②誘導內(nèi)皮細胞的凋亡，細胞凋亡是多細胞生物體維持組織穩(wěn)態(tài)、消除不必要的或已經(jīng)損壞的細胞的一個重要的過程。一些證據(jù)表明，在成人血管，內(nèi)皮細胞凋亡可能限制血管生成和導致血管的衰退［17］。尤其是在腫瘤組織中，內(nèi)皮細胞的凋亡通過阻斷新血管的形成可以有效地防止養(yǎng)分供應。Endostatin可以和血管的內(nèi)皮細胞受體直接結(jié)合，從而引起內(nèi)皮細胞G1期阻滯和細胞凋亡［18］。Bcl-2家族是1個重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白家族，包括如Bcl-2 1種抗凋亡分子和Bax 1種促凋亡分子［19］，Endostatin可以通過抑制bcl-2的表達，誘導內(nèi)皮細胞的凋亡，但并不下調(diào)Bax的表達;③抑制血管內(nèi)皮生長因子，Endostatin可以作用于VEGF的受體，從而直接阻斷VEGF的作用［20］;④抑制基質(zhì)金屬蛋白酶，Endostatin可以與pro-MMP2結(jié)合形成穩(wěn)定的復合體，阻止pro-MMP2的激活，此外，還可以與MMP-2的催化活性基團區(qū)域相結(jié)合，從而抑制其活性［21］;⑤與肝素樣的硫酸蛋白結(jié)合，Endostatin可以與肝素樣的硫酸蛋白相結(jié)合，從而抑制血管的生成，而且肝素與很多抑制血管生成的蛋白都有較高的親和力;⑥與鋅離子結(jié)合，在Endostatin的晶體結(jié)構(gòu)中，N末端結(jié)合了一個鋅離子，鋅與Endostatin是1∶1的復合物，這就認為Endostatin的生物活性與鋅離子可能有關(guān)。

3 Endostatin的抗腫瘤作用

血管生成參與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［22］，當腫瘤體積超過2 mm3時，血管生成就成為腫瘤進展必不可少的過程，腫瘤需要依賴血管生成來提供生長必須的養(yǎng)料并運走廢物，否則腫瘤無法生長，因此，阻止腫瘤生成至關(guān)重要的過程是抑制血管生成。Endostatin作為1種血管生成抑制劑，抑制了腫瘤周圍的新生血管的生成，從而切斷了腫瘤的給養(yǎng)途徑，起到誘導腫瘤缺血和缺氧的效果，這就是有名的“餓死腫瘤學說”。然而，最新的研究表明，Endostatin可以通過規(guī)范腫瘤的血管，減少乏氧細胞的比例，從而減少耗氧量。血管生成促進因子和血管生成抑制因子的共同調(diào)節(jié)腫瘤新生血管的生成。當促進血管生成因子的表達高于抑制因子時，才會在原有血管生成新的血管，bFGF和VEGF都是血管生成促進因子，Endostatin正是通過競爭性結(jié)合硫酸鉆蛋白類受體，或者與VEGF的酪氨酸受體直接相互作用，抑制它們特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，從而達到抑制新生血管的作用。近期有研究發(fā)現(xiàn)Endoustatin除了有抗血管生長的活性之外，在某些腫瘤還可以直接發(fā)揮抗腫瘤的作用。

Endoustatin抗腫瘤治療與傳統(tǒng)抗腫瘤治療相比，Endostatin只針對腫瘤的新生血管，這一特點的的優(yōu)點有:①Endostatin是以內(nèi)皮細胞為作用的靶細胞，而一個內(nèi)皮細胞可以支持50～100個腫瘤細胞的生長，所以，針對血管內(nèi)皮細胞的治療效果更顯著，此外，血管內(nèi)皮細胞相較于腫瘤細胞，其基因型更穩(wěn)定，因此不易產(chǎn)生耐藥性;②Endostatin只對增殖快速的血管內(nèi)皮細胞有抑制作用，對正常的組織幾乎沒有副作用，而血管內(nèi)皮細胞的增殖速度遠遠大于正常細胞的增殖速度，因此，Endostatin的安全性較高;③Endoustatin對腫瘤血管有相對的特異性，因為正常成熟組織的毛細血管內(nèi)皮細胞常常處于靜止狀態(tài)，而腫瘤的血管內(nèi)皮細胞的增殖通常比較活躍，因而會出現(xiàn)許多相對特異的高表達的標記分子，而這些相對特異的高表達的標記分子通常也是Endostatin作用于腫瘤血管的潛在的靶向分子。

4 Endostatin的雙向藥效特點

關(guān)于Endostatin的一個有趣的特點:在體內(nèi)，Endostatin抑制循環(huán)中的內(nèi)皮細胞遵循一個雙向的模式即U型的藥效曲線。比如抗瘤的最佳濃度介于低濃度和高濃度之間。這個特性將指導我們臨床使用Endostatin或其他的血管生成抑制劑。這個現(xiàn)象的發(fā)生最早見于干擾素-a的抗血管生成的活性，隨后在其他的血管生成抑制劑中也相繼出現(xiàn)。擁有27個氨基酸片段的Endostatin也觀察到了這一雙向劑量反應的現(xiàn)象。在一些早期的治療，療效通常不好，甚至失敗，就是因為在使用Endostatin治療時，他們使用了過高的Endostatin藥物濃度，遠遠超過了Endostatin的最佳治療濃度。但是這個現(xiàn)象的出現(xiàn)原因，還沒有找到合理的解釋。

5 Endostatin與放療的結(jié)合

放射治療是腫瘤治療的1種有效手段，在臨床上約有一半以上的腫瘤患者在治療過程中接受過放射治療。而且精確的放射治療被認為是放射治療在21世紀發(fā)展的方向，然而精確放射治療并不能改善惡性腫瘤患者的長期生產(chǎn)率，所以往往單獨接受放射治療的患者治愈率并不高。這可能是因為放射治療可以上調(diào)并增強血管生成通路從而引起放射抵抗，不能控制腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。而且患者在接受放療后可以看到明顯的腫瘤細胞增殖，其原因可能就是上調(diào)血管生成通路的結(jié)果［23］。在放射治療后，腫瘤細胞一般都會出現(xiàn)再氧和的現(xiàn)象，但是，也有一些腫瘤對放射治療沒有一點反應，其原因可能就是在放射治療后增加腫瘤細胞的乏氧、提高腫瘤血管的通透、降低腫瘤血管的灌流量等調(diào)節(jié)血管生成的因素作用的結(jié)果［24-26］。這些影響放射治療后腫瘤血管生成的因素，共同導致了血管的形成，從而引起了降低放療的敏感性，導致放療抵抗的后果。以致對于腫瘤的治療來講，放射治療和血管生成形成了一個難以避免的惡性循環(huán)。如果可以打破這個惡性循環(huán)，腫瘤治療的療效也將明顯的提高。這些問題的存在為放療和抗血管生成抑制劑的聯(lián)合治療提供了機會。所以，安全有效的對放射治療起到增敏作用的抗血管生成抑制劑成為目前研究的關(guān)鍵點。

許多臨床研究表明Endostatin可以提高惡性腫瘤對放射治療的敏感性［27-28］，但其作用機制仍不是很清楚。Teicher等［29］最先發(fā)現(xiàn)抑制血管的生成對放射治療的治療效果起到加強的作用。隨之，很多的亞臨床研究都證實了抗血管生成抑制劑對放射治療有增敏效應提高了放射治療的效果［24，30-37］。而且有研究發(fā)現(xiàn)有許多的抗血管生成抑制劑能在腫瘤治療的早期通過降低或改善腫瘤的乏氧情況來起到放射增敏的效應。有臨床試驗研究證明單獨使用抗血管生成抑制劑治療腫瘤，其效果一直令人失望，原因可能是不同的腫瘤產(chǎn)生不同的作用于腫瘤血管的生長因子，所以，要想提高治療效果，廣譜的抗血管生成抑制劑是必須的。而Edostatin是現(xiàn)階段公認的最有效的抗血管生成抑制劑，而且它可以在腫瘤血管生成的各個過程中發(fā)揮作用。目前研究顯示最可能機制是:Endostatin可以抑制血管生成因子的活性以及內(nèi)皮細胞上的受體，從而間接的抑制了血管的生成;促進了血管內(nèi)皮細胞的凋亡，起到對血管的內(nèi)皮細胞直接增敏的作用;通過規(guī)范腫瘤的血管，減少乏氧細胞的比例，從而減少耗氧量。此外，臨床前的研究表明，Endostatin可以使腫瘤血管瞬間的“正?；?，使其更有效的輸送養(yǎng)，從而提供一個時間窗增強放射治療的敏感性［38-46］。其機制認為是多種作用于腫瘤血管內(nèi)皮細胞的細胞因子使腫瘤的血管在結(jié)構(gòu)和功能上不同于正常組織的血管，而Endostatin可以在腫瘤血管退化前，強化殘留的這種不正常的血管，修剪還未成熟的血管，以改善殘留的血管形態(tài)的完整及功能的正常，從而使腫瘤血管出現(xiàn)瞬間的“正?；?。Endostatin對血管的這些作用，既改善了放療與血管生成對于腫瘤治療的一個惡性循環(huán)，也提高了腫瘤對放療的反應。

假設是在放射治療后誘導了血管的生成，而且開始表達的VEGF可增加血管內(nèi)皮細胞的滲透性、升高了腫瘤的IFP［47］，這樣就和乏氧形成了一個惡性循環(huán)［48］;在這種情況下再放療可能就是無效的。因此，從理論上來看，如果在放療前就預先給予了Endostatin的治療，則可以避免這種惡性循環(huán)的發(fā)生。由于沒有關(guān)于Endostatin和放療的最優(yōu)調(diào)度的準則，Endostatin對于放療的施用時間管理，將是抗腫瘤療法至關(guān)重要的。因此，有關(guān)Endostatin與放療聯(lián)合的最佳作用時間，是以后的實驗研究需要關(guān)注的問題。

在很長的一段時間里，認為血管生成抑制劑因為抗腫瘤血管生成，所以可以通過增加腫瘤細胞的乏氧狀態(tài)來降低腫瘤放療的效果。但隨著進行大量的實驗以及臨床上的研究，證實了血管生成抑制劑聯(lián)合放療將通過減少乏氧細胞的比例，從而減少腫瘤細胞的耗氧量，達到了增強抗腫瘤的效果，而不是傳統(tǒng)意義上的理解。而且Endostatin具有極低的毒性，不易產(chǎn)生耐藥性，只作用于新生血管，對于已經(jīng)形成的血管無作用，容易達到有效藥物濃度，基于這些優(yōu)點，Endostatin是一類具有非常良好應用前景的治療腫瘤的藥物。目前，Endostatin的應用受到臨床上各方面研究的重視，并且腫瘤的綜合治療中已經(jīng)取得了一定的成果。

但是，仍有很多問題需要通過我們進一步的研究來證實，而且現(xiàn)階段的實驗大多數(shù)在體外和動物上體現(xiàn)，其研究結(jié)果可能與臨床有一定的不同。因為在體外實驗或動物實驗，腫瘤血管還沒有生成，或者是形成的早期，而在臨床上，腫瘤的發(fā)現(xiàn)都已經(jīng)是晚期，這時的血管形成已經(jīng)成熟，在這樣的條件下，Endostatin的作用效果就需要進一步的研究證實，此外，Endostatin與放療聯(lián)合的最佳作用時間也是在以后的實驗中需要關(guān)注的焦點。

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