中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化酶法提取胖大海多糖工藝

孫 鵬，裴國(guó)亮，孫先鋒

（1.西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安 710048；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100）

胖大海為梧桐科蘋(píng)婆屬植物（Sterculia lychnophora Hance）的干燥成熟種子，是一種傳統(tǒng)的清咽潤(rùn)喉的中藥材，也是衛(wèi)生部公布第三批藥食兩宜的資源，其具有清熱潤(rùn)肺、利咽解毒、潤(rùn)腸通便的功效。臨床用于肺熱聲啞、干咳無(wú)痰、咽喉干痛、熱結(jié)便閉、頭痛目赤的治療[1-2]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)胖大海的研究較少，僅限于做茶飲、甜點(diǎn)和含片等清咽潤(rùn)喉的保健品，開(kāi)發(fā)利用程度較低，缺乏對(duì)其活性成分的系統(tǒng)研究與利用。多糖是胖大海的主要生物活性成分[3]，目前對(duì)其多糖的提取主要有水煎法、超聲波法和微波法[4-5]，但酶法提取尚未見(jiàn)報(bào)道，本文以胖大海為原料，運(yùn)用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法對(duì)胖大海多糖的纖維素酶提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定纖維素酶提取胖大海多糖的最佳參數(shù)，為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胖大海 購(gòu)自陜西西安老百姓大藥房；纖維素酶 購(gòu)自肇東國(guó)科北方酶制劑有限公司（10000U/g）。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜廠；LG10-2.4型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；SHZ-III循環(huán)水式真空泵 上海亞榮生化儀器廠；FW-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胖大海多糖的提取 將胖大海置于干燥箱中

60℃干燥，自然冷卻后粉碎過(guò)60目篩，精密稱取5g粉末，加入一定體積蒸餾水，將pH調(diào)至4.8，加入一定的纖維素酶攪勻，并置于恒溫水浴搖床中，轉(zhuǎn)速設(shè)定為180r/min，酶解提取完成后將提取容器置于95℃水浴中滅酶6min，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于70℃下濃縮，加入濃縮液1/4體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）[6]，振蕩處理15min，離心獲得（4000r/min，3min）上清液，再加入3倍體積的無(wú)水乙醇，充分?jǐn)嚢桁o置過(guò)夜，離心（5000r/min，10min）得沉淀，沉淀用75%乙醇水溶液分散，再離心，棄去上清液，以此法清洗可除去沉淀中夾帶的少量單糖和低聚糖等水溶性雜質(zhì)。沉淀洗2次后再次離心后的沉淀用蒸餾水溶解并定容到25mL，最后用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。

1.2.2 胖大海多糖測(cè)定及得率計(jì)算 胖大海多糖的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[7]，以葡萄糖（mg/mL）作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定提取液中復(fù)水多糖液中胖大海多糖的含量，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.2756x－0.0076（R2=0.9983）。胖大海多糖的得率計(jì)算如下：Y（%）=[（C×V）/M]×100，式中：Y為胖大海多糖得率（%）；C為由回歸方程求得的胖大海多糖濃度（mg/mL）；V為復(fù)水多糖液體積（mL）；M為胖大海質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察料液比、纖維素酶添加量、酶解溫度和時(shí)間對(duì)胖大海多糖得率的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化確定料液比、纖維素酶酶添加量和酶解時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響。設(shè)定中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平編碼值見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)胖大海多糖得率的影響

稱取胖大海粉末5.0g，稱取5組，每組2份，將料液比分別調(diào)至1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，將pH調(diào)至4.8，加入纖維素酶1.5%，45℃浸提2h，按1.2.1提取胖大海多糖，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著料液比的逐漸增加，胖大海多糖得率逐漸增加，料液比由1∶10增大到1∶30時(shí)，多糖得率顯著增加，繼續(xù)增加料液比后，多糖得率增加緩慢，這主要是由于隨著料液比的增加，胖大海內(nèi)部和溶液主體的多糖濃度差增大，導(dǎo)致推動(dòng)力增大，從而有利于多糖的溶出。當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，大部分多糖已溶出，繼續(xù)增加料液比，導(dǎo)致單位體積提取液中多糖濃度降低，不利于后續(xù)濃縮工作，且對(duì)多糖的得率無(wú)顯著性增加。

2.2 纖維素酶添加量對(duì)胖大海多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取胖大海粉末5.0g，稱取5組，每組2份，料液比1∶25，將pH調(diào)至4.8，加入纖維素酶，使其濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（W∶V），45℃浸提2h，按1.2.1提取胖大海多糖，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著纖維素酶濃度的增加，胖大海多糖得率增大。當(dāng)加酶量大于2.0%時(shí)，繼續(xù)增加酶濃度，多糖得率沒(méi)有明顯提高，說(shuō)明在該底物濃度下，單位底物上的酶濃度已經(jīng)趨于飽和，胖大海多糖已溶出，繼續(xù)增加纖維素酶用量，對(duì)胖大海多糖得率沒(méi)有顯著影響。

2.3 酶解溫度對(duì)胖大海多糖得率的影響

稱取胖大海粉末5.0g，稱取5組，每組2份，料液比1∶25，將pH調(diào)至4.8，加入纖維素酶1.5%，分別在40、45、50、55、60℃下浸提2h，按1.2.1提取胖大海多糖，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，當(dāng)酶解溫度低于50℃時(shí)，胖大海多糖得率隨著溫度的升高而顯著增加；當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，多糖得率隨溫度升高而降低，當(dāng)溫度高于55℃時(shí)，多糖得率迅速降低。這是因?yàn)槊甘且活惥哂凶钸m反應(yīng)溫度范圍的物質(zhì)，過(guò)低溫度會(huì)抑制酶的催化活力，過(guò)高溫度會(huì)導(dǎo)致酶失活。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解溫度為50℃。

2.4 酶解時(shí)間對(duì)胖大海多糖得率的影響

稱取胖大海粉末5.0g，稱取5組，每組2份，料液比1∶25，將pH調(diào)至4.8，加入纖維素酶1.5%，45℃下分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3h，按1.2.1提取胖大海多糖，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，胖大海多糖得率隨著酶解時(shí)間的增加不斷提高，但當(dāng)提取時(shí)間大于2h后，多糖得率增加趨于平緩，說(shuō)明增加酶解時(shí)間可以使纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁中的多糖充分溶出，但酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶的催化活性降低，進(jìn)而對(duì)多糖的得率影響不大。

2.5 胖大海多糖提取工藝優(yōu)化

為優(yōu)化單因素實(shí)驗(yàn)得到的工藝條件，采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酶解工藝的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

應(yīng)用Design Expert 8.06軟件響應(yīng)面分析程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到二次多元回歸模型為：

對(duì)該模型的方差分析見(jiàn)表3，由表3可知，模型p＜0.0001，失擬項(xiàng)p=0.1869＞0.05，相關(guān)系數(shù)R2=0.9960，表明模型的相關(guān)性很好，R2Adj相關(guān)系數(shù)=0.9424，表明響應(yīng)面的94.24%的變化可以由此模型解釋，模型與實(shí)際情況擬合的很好。變異系數(shù)CV越低，實(shí)驗(yàn)的可信度和精確度越高，變異系數(shù)CV=4.41，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，分析結(jié)果可信，因此可以用此回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

由表3還可知，纖維素酶酶解提取胖大海多糖的工藝參數(shù)中，影響多糖得率的因素為：纖維素酶添加量＞酶解時(shí)間＞料液比，其中纖維素酶添加量（X1）和酶解時(shí)間（X3）達(dá)到極顯著水平，料液比（X2）達(dá)到顯著水平，料液比與酶解時(shí)間之間存在交互作用，且達(dá)到極顯著水平。

圖5～圖7為各因素對(duì)響應(yīng)值（胖大海多糖得率）影響的響應(yīng)面圖，其直觀地反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線的圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著[8]。由圖7可知，料液比和酶解時(shí)間的交互作用顯著，而圖5、圖6中兩因素之間的交互作用不顯著。采用Design Expert 8.06軟件分析，得到響應(yīng)面胖大海多糖最大值點(diǎn)對(duì)應(yīng)的各因素的水平分別為纖維素酶添加量1.92%，料液比1∶30.5，酶解時(shí)間126min，此時(shí)胖大海多糖最大理論得率為8.16%。采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行胖大海多糖提取實(shí)驗(yàn)，實(shí)際獲得5組平行實(shí)驗(yàn)平均多糖提取率為7.92%±0.09%，與理論預(yù)測(cè)值誤差為1.84%～4.04%，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)性很好，運(yùn)用中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

影響胖大海多糖得率的工藝參數(shù)按主次順序排列為纖維素酶添加量＞酶解時(shí)間＞料液比。響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳提取工藝條件為纖維素酶添加量1.92%，料液比1∶30.5，pH4.8，50℃下酶解時(shí)間126min，在此條件下，胖大海多糖得率為7.92%±0.09%。

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