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    大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的建立及鑒定*

    2013-03-31 13:03:21商亞珍
    關(guān)鍵詞:原漿傳代貼壁

    范 悅,商亞珍

    (河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所,河北承德 067000)

    神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中除神經(jīng)元以外的另一大類細(xì)胞,廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞有星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,其中星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多,幾乎囊括了所有膠質(zhì)細(xì)胞的功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間存在復(fù)雜的相互作用,以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,對(duì)神經(jīng)元的生存、正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理發(fā)育及病理過(guò)程都具有重要作用[1-2]。本研究探討了如何建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可行的獲得高純度星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法,以期為星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試劑 DMEM-F12培養(yǎng)基,美國(guó)GIBCO公司;胎牛血清,奧地利PAA公司;胰蛋白酶,華美生物工程有限公司;纖維酸性蛋白(GFAP)一抗,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;羊抗兔二抗試劑盒、DAB顯色試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司。

    1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 新生1-3d的SD大鼠,雌雄不限。剪開(kāi)皮膚和顱骨,取兩塊皮質(zhì),預(yù)冷PBS漂洗1-2次后,仔細(xì)剝除腦膜和血管。剪碎,加入0.125%胰蛋白酶置于37℃培養(yǎng)箱中消化30min,消化完全后加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。3500r/min離心5min,棄上清,計(jì)數(shù),以2×105個(gè)/ml的密度接種于用0.1%多聚賴氨酸鋪底的培養(yǎng)瓶中。30min后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,吸出未貼壁的細(xì)胞懸液,重新接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中,差速貼壁以除去成纖維細(xì)胞。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每3d換液一次。

    1.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng) 培養(yǎng)至10-12d,待細(xì)胞80-90%融合時(shí)傳代。加入適量0.1%胰蛋白酶(以剛剛覆蓋細(xì)胞層為宜)后立即于倒置顯微鏡下觀察,待大部分細(xì)胞突起縮回、變圓時(shí),立即吸出培養(yǎng)液,加入少量含10%胎牛血清的培養(yǎng)液直接吹打,待細(xì)胞層脫落。計(jì)數(shù),以密度2×105個(gè)/ml接種于0.1%多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中,當(dāng)7-8d細(xì)胞80-90%融合時(shí),再次傳代。

    1.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 培養(yǎng)第3代的細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板內(nèi)事先用0.1%多聚賴氨酸包被的圓形蓋玻片上,培養(yǎng)48h后進(jìn)行免疫組化染色。吸去24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液,加入PBS漂洗2-3次,加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30min后行免疫組化染色,一抗稀釋度1:100,陰性對(duì)照用PBS代替一抗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,GFAP陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞漿。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 剛接種的細(xì)胞為圓形,胞體較小,3-6h貼壁。3-4d可見(jiàn)細(xì)胞基本呈圓形,長(zhǎng)出細(xì)小突起。5-7d細(xì)胞突起變長(zhǎng),呈梭形、多邊形等形狀。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量增多,胞體變大,逐漸交織成網(wǎng)狀。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快,3-4h貼壁,2-3d呈多種形態(tài),6-7d細(xì)胞80-90%融合。在培養(yǎng)過(guò)程中可偶見(jiàn)神經(jīng)元,但隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和傳代逐漸消失。

    2.2 免疫組化結(jié)果 GFAP陽(yáng)性產(chǎn)物位于細(xì)胞漿,呈棕黃色顆粒狀。細(xì)胞分兩層,上層為纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞,胞核小,突起長(zhǎng)而細(xì);下層為原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞,胞核大,橢圓,形狀不規(guī)則。隨機(jī)選取若干視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),顯示細(xì)胞純度95%以上。

    3 討論

    星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要間質(zhì)細(xì)胞,構(gòu)成神經(jīng)組織網(wǎng)架,具有分裂能力,可分泌和釋放多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,能促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng),形成神經(jīng)元微環(huán)境,具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)功能[3]。

    體外培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞,并非來(lái)自已經(jīng)完全分化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,而是它們的前體細(xì)胞在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中經(jīng)發(fā)育、分化,最終成為成熟的膠質(zhì)細(xì)胞。因此,取材時(shí)間最好在出生后的早期,此時(shí)前體細(xì)胞的數(shù)量接近峰值[4]。另外,使用新生1-3d大鼠的原因是出生后神經(jīng)元不再分裂,可盡量減少神經(jīng)元的污染,且神經(jīng)元不能傳代,經(jīng)過(guò)數(shù)次傳代即可去除神經(jīng)元。而星形膠質(zhì)細(xì)胞大量增殖發(fā)生在胚胎晚期和出生后,生長(zhǎng)旺盛[5]。而且1-3d新生大鼠腦膜和血管較好剝離,盡量剝除腦膜和血管可以減少成纖維細(xì)胞的污染[6]。

    本研究免疫組化結(jié)果顯示,培養(yǎng)的為混合星形膠質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞分為上下兩層,纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞和原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞都屬于星形膠質(zhì)細(xì)胞,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求不同,將兩種細(xì)胞分開(kāi)培養(yǎng)[7]。原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞多分布于腦和脊髓的灰質(zhì),含膠原纖維少,細(xì)胞體較大,突起寬而扁,分支少;纖維性星形膠質(zhì)細(xì)胞多分布于腦和脊髓的白質(zhì),細(xì)胞內(nèi)富含膠原纖維,突起細(xì)長(zhǎng),分支多[8]。

    星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多的一種除了以往認(rèn)識(shí)的在神經(jīng)系統(tǒng)中有營(yíng)養(yǎng)支持作用外,與神經(jīng)元之間還存在復(fù)雜的相互作用,也與許多神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān),尤其是神經(jīng)炎癥反應(yīng),由星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子介導(dǎo)。膠質(zhì)細(xì)胞的異常改變直接影響神經(jīng)功能的正常發(fā)揮[9-10]。因此,建立星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法有利于探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病中的角色,以及研究藥物的作用及機(jī)制。

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