HPLC檢測復(fù)合魚肝油制劑中維生素A含量的可行性

李東文

復(fù)合魚肝油制劑是由魚肝油、維生素及其他輔料制成的，魚肝油是由海魚中提煉的一種脂肪油，主要成分是維生素A，可促進(jìn)視覺細(xì)胞內(nèi)感光色素的形成，調(diào)試眼睛適應(yīng)外界光線強(qiáng)弱的能力，以降低夜盲癥和視力減退的發(fā)生，維持正常的視覺反應(yīng)。此外魚肝油中的維生素D有助于促進(jìn)人體對鈣的吸收，有助于預(yù)防嬰幼兒缺乏維生素D會引起佝僂病，成人缺乏維生素D會造成骨骼軟化癥［1］。維生素A攝入過量也會引起副作用，可損害腦組織等，因維生素制劑含量的控制十分重要［2］，目前維生素A常用的檢測方法有熒光光分度法、液相色譜法等［3］，本文筆者采用高效液相色譜法檢測復(fù)合魚肝油制劑中維生素A的含量，為復(fù)合魚肝油制劑的質(zhì)量監(jiān)控提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

采用島津LC-10ATVP高效液相色譜儀，AT-201電子分析天平(瑞士梅特勒)，島津UV-2550紫外-可見分光光度計(jì);維生素A對照溶液(廣州珠江制藥廠提供);復(fù)合魚肝油制劑由山東達(dá)因海洋生物制藥股份有限公司提供，規(guī)格為500ml/瓶，批號為 101005、101012、101024。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜 設(shè)定色譜柱為Kromasil+C18(250 mm×46 mm)，流動相為甲醇-水98∶2，設(shè)置流速為1 ml/min，檢測波長為328 nm。

2.2 對照溶液的制備 取廣州珠江制藥廠提供的維生素A醋酸酯50 mg，由天平稱量后放于50 ml容量瓶中，容量瓶中放入環(huán)己烷配置維生素A醋酸酯濃度為1 mg/ml的對照溶液準(zhǔn)備溶液。進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)時用吸管吸取準(zhǔn)備液1 ml，放入50 ml容量瓶中，采用甲醇稀釋，獲得維生素 A醋酸酯濃度為0.02 mg/ml的對照溶液溶液。

2.3 測試溶液制備 精密抽取復(fù)合魚肝油制劑5 ml放于分液漏斗中，加無水乙醇20 ml后搖勻，然后加入環(huán)己烷25 ml，用力搖勻后靜置，棄水層后留置液體采用無水硫酸鈉濾紙過濾，取濾液5 ml置于25 ml容量瓶中，采用甲醇稀釋至刻度即得測試溶液溶液［4］。陰性測試溶液選擇不含維生素A的樣品，制備方法同測試溶液。

2.4 線性關(guān)系判定 分別抽取維生素A醋酸酯準(zhǔn)備液1、2、3、4、5 ml，分別采用乙醇稀釋為濃度為 22.036、44.168、66.304、88.262、110.350 的對照溶液溶液，分別進(jìn)樣 20 μl后行色譜測定，色譜條件按2.1進(jìn)行;以對照溶液進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)計(jì)算后可得如下回歸方程，Y=60 172 X+61 689，r=0.998 6。由回歸方程可見，在 22.036 ～11.350 mg/L范圍內(nèi)，維生素A進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 抽吸測試溶液溶液進(jìn)樣20 μl進(jìn)行色譜測定，重復(fù)進(jìn)樣色譜測定6次，均測量維生素A的峰值面積，6次測量結(jié)果RSD為0.19%。

2.6 對照實(shí)驗(yàn) 分別精密抽取對照溶液、測試溶液、陰性測試溶液，均進(jìn)樣20 μl后進(jìn)行色譜測定，維生素A色譜顯示清晰，陰性測試溶液未見維生素A干擾峰出現(xiàn)。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一測試溶液，在常溫下0、2、4、6、8、10小時時進(jìn)樣20 μl分別進(jìn)行色譜測定，統(tǒng)計(jì)分析6次測量的維生素A的峰值面積，計(jì)算RSD為0.45%。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn) 取101012批次樣品9份，分別加入定量的對照溶液，然后按2.3方法制備測試溶液后，9份現(xiàn)制備的測試溶液分別進(jìn)樣20 μl，然后測定回收率，見表1。

表1 6份樣品加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.9 樣品含量測定實(shí)驗(yàn) 取3個批次待檢魚肝油制劑，每個批次選擇3份樣品，按2.3方法制定測試樣品，進(jìn)樣數(shù)20 μl后測定樣品含量，然后計(jì)算整瓶樣品中維生素含量。見表2。

表2 3個批次9份樣品維生素A含量測定

3 討論

魚肝油是由海魚的肝臟內(nèi)提煉的油脂，其中含有大量維生素，包括維生素A維生素D中，可有效預(yù)防小兒夜盲、佝僂癥，成人骨軟化癥等。魚肝油收錄于《藥典》2005版本，目前維生素A含量測定方法主要有高效液相色譜法、紫外分光光度法、熒光分光光度法［5］。

本文高效液相色譜法對魚肝油中的維生素A進(jìn)行質(zhì)量控制。流動相采用甲醇-水(98∶2)，原因在于實(shí)驗(yàn)研究顯示98∶2甲醇-水流動相相對95∶5，90∶10流動相有更好的分離效果及峰值波形［6］。另外《藥典》中供試品溶液的制備直接采用環(huán)己烷溶解，但是魚肝油復(fù)合制劑中輔料較多，會干擾波形，并且按傳統(tǒng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)采用無水乙醇、環(huán)己烷、水共提，溶液不易分層，并且會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象［7］，本文筆者采用環(huán)己烷和無水乙醇共同提取，原因在于研究顯示環(huán)己烷無水乙醇共同提取，提取率可達(dá)原標(biāo)準(zhǔn)的98%，而單獨(dú)環(huán)己烷提取，提取率僅達(dá)原標(biāo)準(zhǔn)的68%。

總之，本研究顯示，HPLC檢測復(fù)合魚肝油制劑中維生素A含量方法簡單，波形清晰，結(jié)果可靠，精密度和回收率均較高，可作為該制劑主要含量控制方法。

1 陳詠，樓永明.固相萃取-HPLC法測定魚肝油乳中維生素A的含量.海峽藥學(xué)，2009，21:46

2 潛麗俊，劉晟，楊麗軍.慢性維生素A中毒16例誤診分析.浙江臨床醫(yī)學(xué)，2002，4:465-466.

3 Song JC，Li YQ，Zeng JF.Determination of Vitamin D2，Vitamin A and Vitamin E in Cernevit-12 for Injection by HPLC.China Pharmacy，2007，18:2456-2457.

4 黃敏，黃增瓊，蔣偉哲，等.高效液相色譜法測定復(fù)合魚肝油制劑中維生素A的含量.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，24:600-601.

5 國家藥典委員會主編.中國藥典2005版.二部.附錄.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.46-47.

6 Shaoqing HU.Determination of Vitamin A in Compound Morrhuate Preparation by HPLC.China Medical Herald，2011，8:101-102.

7 胡漳程.HPLC法測定三維魚肝油乳中的維生素A含量.海峽藥學(xué)，2009，21:68-69.