β3受體阻斷劑對(duì)心力衰竭大鼠心肌解偶聯(lián)蛋白2和能量代謝變化的影響*

高艷輝，高海波，狄寧寧，孔一慧△，李為民

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，黑龍江哈爾濱150001；2.哈爾濱工程大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，黑龍江哈爾濱150001）

心力衰竭（heart failure，HF）是許多心血管疾病的終末階段，心肌能量代謝障礙在其發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用［1］。解偶聯(lián)蛋白 2（uncoupling protein 2，UCP2）作為線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以將內(nèi)膜外側(cè)的H＋運(yùn)回內(nèi)側(cè)，降低物質(zhì)氧化過程中H＋形成的膜兩側(cè)電化學(xué)梯度，解除呼吸鏈氧化磷酸化和ATP合成的偶聯(lián)，使H＋氧化過程中釋放出的能量轉(zhuǎn)化為熱能，ATP生成減少［2］。HF時(shí)心肌β3-受體（β3-adrenergic receptor，β3-AR）表達(dá)增加約 2～3倍，且過多激動(dòng)，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)β3-AR激動(dòng)劑能使平滑肌組織中UCP2表達(dá)上調(diào)［3］，因此本實(shí)驗(yàn)通過HF大鼠模型，觀察HF時(shí)心肌β3-AR、UCP2表達(dá)及心肌能量代謝變化，探討β3-AR阻斷劑是否通過降低UCP2表達(dá)，改善HF時(shí)心肌能量代謝和心臟功能。

1 材料與方法

1.1 心力衰竭大鼠模型建立與分組

雄性 Wistar大鼠60只，體重（200±20）g，購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，隨機(jī)分成2組，對(duì)照組7只，HF組53只。HF組給予異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO，美國(guó) Sigma公司）340 mg／kg皮下注射2次，間隔24 h。8周后，HF組存活39只大鼠，存活的 HF大鼠隨機(jī)分成 2組：（1）ISO＋SR59230A組：21只，SR59230A（85 nmol溶于 1 ml生理鹽水，美國(guó)Sigma公司），每日2次腹腔注射，共6周；（2）ISO組：18只，ISO組給予相應(yīng)生理鹽水 1 ml，每日2次腹腔注射。對(duì)照組不予處置。治療6周后ISO組和 ISO＋SR59230A組分別死亡9只、3只大鼠。隨機(jī)選取兩組中左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜70%的大鼠7只與對(duì)照組比較。

1.2 心臟超聲檢查

將大鼠用水合氯醛（100 mg／kg）腹腔注射麻醉后，取左側(cè)臥位，應(yīng)用探頭頻率為12 MHz進(jìn)行心臟超聲檢查。取胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面，用M型超聲測(cè)定左室舒張末期直徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左室收縮末期直徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）等指標(biāo)，測(cè)定值均為連續(xù)5個(gè)心動(dòng)周期測(cè)得的均值。

1.3 左室重量與體重比值測(cè)定

麻醉后測(cè)定大鼠體重，開胸取出心臟用PBS沖去殘血，濾紙吸干表面，分離左室，測(cè)定左室重量／體重（left ventricle weight／body weight，LVW／BW）。

1.4 RT-PCR方法測(cè)定心肌組織β3-AR、UCP2 mRNA表達(dá)

應(yīng)用Trizol法提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按說明PCR儀擴(kuò)增，電泳后應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析處理，計(jì)算β3-AR、UCP2mRNA與GAPDH mRNA灰度比值（引物由南京金思特科技有限公司合成），各指標(biāo)引物序列、退火溫度見表1。

Tab.1 Reaction conditions of UCP2，β3-AR and GAPDH mRNA by RT-PCR method

1.5 Western blot測(cè)定心肌組織UCP2蛋白表達(dá)

取大鼠心肌組織約300 mg勻漿提取線粒體蛋白，按考馬斯亮藍(lán)試劑盒操作檢測(cè)蛋白濃度。SDS PAGE（十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺）凝膠電泳。取各組蛋白50μg使其變性。電泳后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用麗春紅S染膜，觀察轉(zhuǎn)移效果。將膜用PBS液（成分：Na2HPO4、NaH2PO4和 H2O，pH 7.4）洗 3遍，加入一抗（英國(guó)Abcom公司），4℃封閉過夜，第2天加入二抗（北京中杉生物技術(shù)有限公司）37℃1 h后顯色。

1.6 高效液相色譜法測(cè)定心肌組織ATP、PCr含量

取大鼠心肌組織約100 mg勻漿，離心。色譜條件：C18柱（250 mm×4.60 mm，粒徑5μm），流動(dòng)相為50 mmol／L的磷酸鹽-甲醇緩沖液（pH 6.0），流速 1 ml／min，柱溫為室溫 25℃，ATP和 PCr檢測(cè)波長(zhǎng)分別為254 nm和210 nm，進(jìn)樣量20μl。根據(jù)一系列已知濃度的樣品以濃度對(duì)峰面積作回歸處理繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定各組大鼠心肌組織ATP、PCr含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有指標(biāo)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，檢驗(yàn)資料符合正態(tài)分布，組間具有方差齊性再進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用 q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 心臟超聲

M型超聲測(cè)定其LVESD及LVEDD、EF，并計(jì)算FS值，結(jié)果顯示造模成功的大鼠心功能較對(duì)照組明顯下降。與對(duì)照組比較，ISO組、ISO＋SR59230A組LVESD及LVEDD明顯增大，LVEF及FS則明顯降低（P均 ＜0.01）；ISO＋SR59230A組與 ISO組比較，LVEDD以及LVESD減小，LVEF及FS升高（P均＜0.05，表 2）。

Tab.2 Results of echocardiography（ˉx±s，n＝7）

2.2 心室重構(gòu)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，ISO組和 ISO＋SR59230A組LVW增大，BW降低，但各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而 LVW／BW明顯增大（P＜0.01）；與ISO組比較，ISO＋SR59230A組LVW／BW降低（P＜0.05，表 3）。

Tab.3 LV weight，body weight and ratio of LV weight and body weight（ˉx±s，n＝7）

2.3 RT-PCR測(cè)定心肌組織β3-AR、UCP2 mRNA表達(dá)

β3-AR mRNA及UCP2mRNA變化趨于一致。與對(duì)照組相比，ISO組β3-ARmRNA及UCP2mRNA顯著增加（P＜0.01），與 ISO組相比，ISO＋SR59230A組β3-AR mRNA及 UCP2mRNA減少（P＜0.05，圖 1、表4）。

Fig.1 GAPDH，UCP2 andβ3-AR mRNA expression by RT-PCR in left ventricular UCP2：Uncoupling protein 2；β3-AR：β3-adrenergic receptor A，B，Care mRNA expression results by RT-PCRfor GAPDH，UCP2，β3-AR；M：DNA Marker；1：Control group；2：ISO group；3：ISO＋SR59230A group

Tab.4 Ratio ofβ3-AR，UCP2 and GAPDH mRNA level by RTPCR（ˉx±s，n＝7）

2.4 心肌組織UCP2蛋白表達(dá)

ISO組大鼠心肌組織UCP2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。與 ISO組比較，SR59230A干預(yù)可以下調(diào) UCP2蛋白表達(dá)（P＜0.05，圖 2），但其仍高于對(duì)照組。

Fig.2 UCP2 protein expression by Western blot in left ventricular UCP2：Uncoupling protein 2；M：DNA Marker；1：Control group；2：ISO group；3：ISO＋SR59230A group*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs ISO group

2.5 ATP and PCr水平

ATP在各組心肌中含量沒有明顯差異，但是與對(duì)照組比較，ISO組和ISO＋SR59230A組PCr含量明顯減少（P均 ＜0.01），PCr／ATP降低（P＜0.01，P＜0.05），與 ISO組比較，SR59230A干預(yù)可抑制 PCr含量和 PCr／ATP下降（P均 ＜0.01，表 5）。

Tab.5 Content of myocardium ATPand PCr of every group（ˉx±s，n＝7）

2.6 心肌組織UCP2蛋白表達(dá)與PCr／ATP相關(guān)性分析

心肌組織UCP2蛋白表達(dá)與PCr／ATP呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.82，P＜0.01，圖 3）。

Fig.3 Correlation analysis between myocardial UCP2 protein expression and the ratio of PCr／ATP UCP2：Uncoupling protein 2；PCr：Creatine phosphate

3 討論

確切動(dòng)物模型的建立是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的首要條件之一。ISO是心肌毒性最強(qiáng)的一類兒茶酚胺，有研究表明較大劑量（＞85 mg／kg）的ISO可以造成心肌彌漫性壞死，并逐漸進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌病HF。本文應(yīng)用大劑量（340 mg／kg）ISO后，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行心臟超聲方面檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ISO組心功能較正常大鼠明顯惡化，與文獻(xiàn)報(bào)道相似［4］。

研究發(fā)現(xiàn)激動(dòng)β3-AR可引起平滑肌和脂肪組織UCP2表達(dá)上調(diào)［3］，本研究證實(shí) HF大鼠心肌β3-AR和UCP2表達(dá)上調(diào)，通過 SR59230A阻斷β3-AR后UCP2表達(dá)下降，提示HF時(shí)UCP2表達(dá)上調(diào)與β3-AR上調(diào)和過多激動(dòng)相關(guān)，具體機(jī)制尚不清楚，可能與HF時(shí)β3-AR過多激動(dòng)引起ROS和FFA增加有關(guān)。HF時(shí)，大鼠心肌β3-AR上調(diào)，氧化應(yīng)激指標(biāo)明顯增強(qiáng)［4］，ROS可上調(diào) UCP2表達(dá)并使其活性增強(qiáng)［2］，提示本實(shí)驗(yàn)UCP2表達(dá)增加與β3-AR上調(diào)，ROS增加有關(guān)；β3-AR激動(dòng)發(fā)揮脂解作用，HF大鼠心肌β3-AR上調(diào)，血漿 FFA含量增加［5］，血漿 FFA增高可上調(diào)UCP2mRNA表達(dá)［2］，提示UCP2表達(dá)增加可能與HF大鼠β3-AR上調(diào)，血漿FFA增加有關(guān)。SR59230A通過能阻斷β3-AR，降低脂解作用，減少血漿FFA，減少HF大鼠心肌氧化應(yīng)激水平，因此推斷本實(shí)驗(yàn)SR59230A下調(diào)心肌UCP2表達(dá)可能是通過上述共同作用的結(jié)果。另外，鄒原等研究發(fā)現(xiàn)胃迷走神經(jīng)切除后，UCP2表達(dá)上調(diào)，說明HF時(shí)UCP2表達(dá)增加也與交感神經(jīng)興奮有關(guān)［6］。

心臟是一個(gè)高耗能器官，ATP直接供能，PCr則儲(chǔ)存能量，二者相互轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)，HF大鼠心肌UCP2表達(dá)增加，解偶聯(lián)作用增強(qiáng)，反應(yīng)向能量?jī)?chǔ)備方向減少，生成 PCr減少，PCr／ATP比值降低，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)UCP2表達(dá)與PCr／ATP比值呈明顯負(fù)相關(guān)，提示HF時(shí) PCr含量減少、PCr／ATP降低與心肌UCP2表達(dá)上調(diào)有關(guān)，應(yīng)用β3-AR阻斷劑主要通過減少UCP2表達(dá)改善能量代謝，增加ATP的生成，增加能量?jī)?chǔ)備。另外其他機(jī)制也可能參與心肌能量代謝障礙這一過程，HF時(shí)，ROS產(chǎn)生增加，可抑制線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物，還可引起線粒體DNA的損傷，進(jìn)而引起能量障礙［7］，β3-AR阻斷劑通過抑制氧化應(yīng)激［4］從而改善能量代謝。

本研究證實(shí)SR59230A改善HF大鼠心臟功能，機(jī)制可能是阻斷β3-AR和下調(diào)UCP2表達(dá)共同作用的結(jié)果。β3受體與Gi蛋白相連，刺激一氧化氮合酶（NOS），促進(jìn)一氧化氮（NO）產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）增加，降低心肌收縮力［8］，SR59230A可阻斷此作用，從而改善心臟功能；另一方面，HF時(shí)心肌UCP2的表達(dá)，引起能量代謝障礙，不論心肌的收縮和舒張均是一個(gè)耗能的過程，能量代謝異常將惡化心臟功能，同時(shí)Turner等發(fā)現(xiàn)UCP2表達(dá)增加，線粒體膜電勢(shì)降低，對(duì)胞漿Ca2＋攝取減少，導(dǎo)致舒張期Ca2＋的消散延長(zhǎng)，易化了鈣活化的產(chǎn)生，可產(chǎn)生局部不同步的鈣釋放，惡化心肌興奮-收縮偶聯(lián)［9］，對(duì)心功能產(chǎn)生不利影響，而這一作用是獨(dú)立于能量代謝障礙，SR59230A通過下調(diào)UCP2的表達(dá)改善心臟功能；此外，SR59230A通過下調(diào)β3受體和 UCP2，降低了LVW／BW比值，改善心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)指標(biāo)，改善心臟功能。

［1］ Kohlhaas M，Maack C.Interplay of defective excitation-contraction coupling，energy starvation，and oxidative stress in heart failure［J］.Trends Cardiovasc Med，2011，21（3）：69-73.

［2］ Rousset S，Alves-Guerra MC，Mozo J，et al.The biology of mitochondrial uncoupling proteins［J］.Diabetes，2004，53（Suppl 1）：S130-S135.

［3］ Nakamura Y，Nagase I，Asano A，et al.Beta3-adrenergic agonist up-regulates uncoupling protein 2 and 3 in skeletal muscle of the mouse［J］.JVet Med Sci，2001，63（3）：309-314.

［4］ 孔一慧，張 穎，李 娜，等.心力衰竭心肌β3腎上腺素能受體與氧化應(yīng)激關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華心血管病雜志，2010，38（5）：435-439.

［5］ Opie LH，Knuuti J.The adrenergic-fatty acid load in heart failure［J］.J Am Coll Cardiol，2009，54（18）：1637-1646.

［6］ 鄒 原，楊 梅，宮德正，等.迷走神經(jīng)切除對(duì)大鼠胃內(nèi)UCP2mRNA表達(dá)及胃酸分泌的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2005，21（3）：290-292.

［7］ Shen GX.Oxidative stress and diabetic cardiovascular disorders：roles of mitochondria and NADPH oxidase［J］.Can J physiol Pharmacol，2010，88（3）：241-248.

［8］ Gauthier C，Leblais V，Kobzik L，et al.The negative inotropic effect ofβ3-adrenoceptor stimulation is mediated by activation of a nitric oxide synthase pathway in human ventricle［J］.J Clin Invest，1998，102（7）：1377-1384.

［9］ Turner JD，Gaspers LD，Wang G，et al.Uncoupling protein-2 modulates myocardial excitation-contraction coupling［J］.Circ Res，2010，106（4）：730-738.