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    濃香型大曲糖化動(dòng)力學(xué)研究

    2013-03-20 03:33:48張曉宇
    食品與機(jī)械 2013年1期
    關(guān)鍵詞:糖化酶濃香型大曲

    任 飛 張曉宇

    (1.西南科技大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)研究所,四川 綿陽(yáng) 621010;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫 214122)

    以瀘州老窖為代表的濃香型大曲酒是以己酸乙酯為主體香味成分,其風(fēng)格特征:窖香濃郁,綿甜爽凈,回味悠長(zhǎng)[1]。幾十年來(lái),濃香型大曲酒深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。濃香型大曲含有多種微生物產(chǎn)生的多種酶類,是濃香型大曲酒生產(chǎn)的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑,其品質(zhì)對(duì)曲酒的出酒率和酒質(zhì)都有很大的影響,所以有“曲是酒之骨”的說(shuō)法[2]。濃香型大曲酒的釀造是在中溫(或中溫偏高溫)大曲的作用下,進(jìn)行“雙邊”發(fā)酵——邊糖化邊發(fā)酵。在大曲酒的發(fā)酵過(guò)程中,濃香型大曲的作用如下:①為大曲酒的入窖糟醅中原料的分解提供酶類:液化酶類、糖化酶類、蛋白酶類、脂肪酶類,等等;②為大曲酒的發(fā)酵提供主要菌種來(lái)源,如霉菌、酵母菌、細(xì)菌等;③是大曲酒中一些香味物質(zhì)及香味前體物質(zhì)的來(lái)源;④大曲中淀粉含量高達(dá)57%左右,可以為大曲酒的發(fā)酵提供一部分發(fā)酵原料[3]。濃香型大曲中的糖化酶類主要源于微生物在制曲過(guò)程中新陳代謝作用,糖化酶類在大曲酒生產(chǎn)的邊糖化邊發(fā)酵過(guò)程中起著重要作用。在本試驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定大曲的糖化酶類的糖化動(dòng)力學(xué),研究不同反應(yīng)條件(底物濃度、酶用量、溫度、pH)對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率的影響,為濃香型大曲酒的生產(chǎn)工藝控制提供理論的參數(shù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大曲:來(lái)自于四川濃香型大曲酒生產(chǎn)廠家。

    乙酸鈉、乙酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉、葡萄糖、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸:均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑有限公司。

    試驗(yàn)用水:均為純凈水。

    1.2 儀器與設(shè)備

    數(shù)字酸度計(jì):PHS-25,上海雷磁儀器廠;

    電子分析天平:BSA124S,德國(guó)Sartorius公司;

    電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:DGF3006A,重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 可溶性淀粉溶液的制備 準(zhǔn)確稱取可溶性淀粉,加少量水調(diào)勻,加入沸水中,繼續(xù)煮沸至透明,冷卻后用水定容,制得試驗(yàn)所需的淀粉溶液。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋成不同濃度的淀粉溶液。

    1.3.2 5%大曲浸出液的制備 5.0g大曲(以絕干曲計(jì)),加入90mL水和10mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,攪勻,于30 ℃水浴中保溫浸取1h,每隔15min攪拌1次。用脫脂棉過(guò)濾,濾液為5%大曲浸出液(酶液),取上清液置于冰水浴中待用。使用前5min將所需量的大曲浸出液取出,裝入干凈的試管中置于糖化反應(yīng)所需溫度的水浴中,使其達(dá)到需要的溫度。

    1.3.3 緩沖液的制備 為了測(cè)定pH 值對(duì)大曲糖化力的影響,需配制pH 值為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液[4]。

    1.3.4 還原糖含量的測(cè)定 斐林試劑法[5]。

    1.3.5 糖化反應(yīng)速率的計(jì)算 因?yàn)樵谥袦匕l(fā)酵時(shí),反應(yīng)溫度常控制在30 ℃左右。在本試驗(yàn)中,除研究溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響外,反應(yīng)溫度均控制在30 ℃。根據(jù)要求改變底物(可溶性淀粉)濃度、酶濃度(酶液用量)、糖化反應(yīng)的pH 值、反應(yīng)溫度,進(jìn)行試驗(yàn),糖化反應(yīng)時(shí)間均為5 min,糖化反應(yīng)結(jié)束時(shí)用0.1mol/L的NaOH(注:測(cè)定pH 對(duì)糖化反應(yīng)速率的影響時(shí)用0.2mol/L的NaOH)溶液15 mL 終止反應(yīng),定容至50mL,取5mL反應(yīng)液用斐林試劑法測(cè)定反應(yīng)液中還原糖的含量。同時(shí)做空白對(duì)照,糖化反應(yīng)速率按式(1)計(jì)算:

    式中:

    V—— 糖化反應(yīng)速率,mg/(mL·min);

    V1——5mL 糖化液消耗0.1% 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;

    V0—— 空白對(duì)照消耗的消耗的0.1% 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積,mL;

    C —— 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度,mg/mL。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 底物濃度對(duì)大曲糖化速率的影響

    以不同濃度的可溶性淀粉作為底物,大曲浸出液用量5mL,反應(yīng)溫度30 ℃,準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后,加入0.1 mol/L的NaOH 溶液15mL,終止反應(yīng),定容至50 mL。研究底物濃度變化對(duì)大曲糖化反應(yīng)初速率的影響,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖1 底物濃度對(duì)糖化反應(yīng)速率的影響Figure 1 Effect of substrate on initial rate of saccharification

    大曲糖化反應(yīng)是大曲中含有的多種糖化酶共同參與的結(jié)果。由圖1可知,反應(yīng)速率V 對(duì)[S]呈典型的雙曲線關(guān)系符合經(jīng)典的表征酶促反應(yīng)特征的米氏方程的曲線形狀。因此,可將本試驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)與米氏方程進(jìn)行擬合,用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以1/V ~1/[S]作圖,得到如圖2所示的直線。由回歸方程:

    可 求 出Vmax=0.148 0 mg/(mL· min),Km=25.935 7mg/mL,所以大曲糖化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程為

    圖2 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法Figure 2 Lineweaver-Burk plot of initial rate of saccharification with substrate concentration

    2.2 酶用量對(duì)反應(yīng)速率的影響

    底物濃度為15mg/mL,反應(yīng)溫度為30 ℃,pH 為4.6,糖化酶用量對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率的影響見(jiàn)圖3。由圖3 可知,酶用量與糖化反應(yīng)速率呈線性關(guān)系。當(dāng)?shù)孜餄舛缺让笣舛却蠛芏?,即[S]>>[E],因此被酶結(jié)合的S 量,亦即[ES],它與總的底物濃度相比,可以忽略不計(jì)。根據(jù)酶反應(yīng)的中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)[6]得出式(4):

    上述兩步反應(yīng)都是可逆的,它們的正反應(yīng)與逆反應(yīng)的速率常數(shù)分別為k1、k2、k3、k4,可以推導(dǎo)得出:

    圖3 酶用量對(duì)糖化速率的影響Figure 3 Effect of enzyme concentration on initial rate of saccharification

    式(5)表明酶反應(yīng)體系中反應(yīng)速率V 與酶濃度[E]呈正比,與試驗(yàn)結(jié)果相符。

    在濃香型大曲酒的生產(chǎn)中,可以通過(guò)大曲的用量來(lái)控制糖化反應(yīng)速率,夏季氣溫較高,要使大曲酒的發(fā)酵過(guò)程符合“前緩、中挺、后緩落”,必須減少用曲量,一般情況下,夏季的用曲量為投糧量的18%,冬季用曲量為投糧量的21%[6,7]。

    2.3 pH 對(duì)糖化速率的影響

    底物濃度為15mg/mL,糖化反應(yīng)的溫度為30 ℃,酶用量為5mL,利用5mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)劑反應(yīng)體系的pH 值,研究在不同的pH 條件下大曲糖化反應(yīng)速率,反應(yīng)結(jié)束時(shí),用0.2mol/L 的NaOH 溶液終止反應(yīng),試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,當(dāng)pH 值在3.0~6.0時(shí),糖化反應(yīng)速率隨pH 值的升高而逐漸增加;當(dāng)pH 值在6.0~8.0時(shí),糖化反應(yīng)速率隨pH 的升高而逐漸降低;因此,濃香型大曲糖化酶的最適pH 為6.0。

    圖4 pH 對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率的影響Figure 4 Effect of pH on the initial rate of saccharification

    在釀造濃香型大曲酒的過(guò)程中,控制入窖糟醅的pH 可以控制糖化反應(yīng)的速率,有利影響有3個(gè)方面:①過(guò)酸或過(guò)堿可導(dǎo)致酶活性的喪失,空間結(jié)構(gòu)被破壞;②當(dāng)pH 值的改變不太劇烈時(shí),酶雖未變性,活力可能受到影響;③pH 可影響維持酶分子的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)基團(tuán)的解離,進(jìn)而影響酶活性部位的構(gòu)象,酶的活性可能受到影響[8]。

    由圖4可知,大曲糖化反應(yīng)速率與pH 呈鐘罩形曲線,表明pH 對(duì)大曲中糖化酶類的糖化反應(yīng)的影響與對(duì)單一糖化酶的影響類似。“雙邊發(fā)酵”順利地進(jìn)行,可以提高大曲酒的質(zhì)量和產(chǎn)量。

    2.4 溫度對(duì)大曲糖化速率的影響

    溫度是影響酶活性的重要因素,研究酶的最適溫度,在工業(yè)生產(chǎn)中有重要的意義[9]。底物濃度為15 mg/mL,pH為4.6,酶液用量為5mL,在不同的溫度條件下測(cè)定大曲的糖化反應(yīng)速率,溫度對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率的影響見(jiàn)圖5。

    由圖5可知,在10~50 ℃時(shí),大曲的糖化反應(yīng)速率隨著溫度的升高而增加。這是因?yàn)楫?dāng)溫度升高時(shí),酶催化反應(yīng)與一般化學(xué)反應(yīng)一樣,反應(yīng)速率加快[8]。在通常情況下,窖池內(nèi)糟醅的發(fā)酵溫度最高不會(huì)超過(guò)40 ℃。在這一溫度范圍之內(nèi),大曲的糖化反應(yīng)速率隨著溫度的升高而增加。酵母菌在高溫下過(guò)早衰亡,使得發(fā)酵無(wú)法徹底地進(jìn)行下去,到發(fā)酵中期,發(fā)酵相當(dāng)微弱,所以導(dǎo)致了出酒率的下降[6]。濃香型大曲酒傳統(tǒng)的入窖溫度是“熱平地溫冷13 ℃”,也就是控制較低的溫度入窖發(fā)酵,控制“低溫緩慢發(fā)酵”,做到“前緩、中挺、后緩落”。夏季氣溫較高應(yīng)調(diào)整作息時(shí)間,利用氣溫較低的夜間和早晨進(jìn)行生產(chǎn),盡量避免在氣溫較高的中午進(jìn)行生產(chǎn),來(lái)減慢糖化反應(yīng)的速率[10,11]。由表1可知,溫度對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率有較大的影響,濃香型大曲糖化反應(yīng)速率是溫度的函數(shù)。

    圖5 溫度對(duì)大曲糖化反應(yīng)初速率的影響Figure 5 Effect of temperature on the initial rate of saccharification

    表1 不同溫度下的糖化反應(yīng)速度Table 1 Initial rate of saccharification in different temperature

    將表1中的試驗(yàn)數(shù)據(jù),以lnV-1/T 作圖,可得如圖6所示的直線,R2=0.988 1,說(shuō)明用阿侖尼烏斯方程擬合本試驗(yàn)數(shù)據(jù)是高度顯著的,表明糖化反應(yīng)速度隨溫度的變化服從阿累尼烏斯(Arrhenius)方程:

    式中:

    A—— 指前因子;

    E—— 活化能,J/mol;

    R—— 通用氣體常數(shù),8.314J/(mol·K);

    T—— 開(kāi)氏溫度,K。

    可求出:指前因子A =6.21×105mg/(mL·min),活化能E =40.966kJ/mol;與鐘穗生等[12]報(bào)道的馬鈴薯淀粉糖化反應(yīng)的活化能E =41.165kJ/mol比較接近。

    圖6 lnv 與1 000/T 的關(guān)系圖Figure 6 Relationship of lnv with 1 000/T

    3 結(jié)論

    濃香型大曲作為濃香型大曲酒生產(chǎn)的糖化發(fā)酵劑,含有由多種微生物產(chǎn)生的多種糖化酶。用5%濃香型大曲浸出液水解可溶性淀粉,在pH 4.6、30 ℃的條件下,濃香型大曲糖化酶的米氏方程為V =0.148 0[S]/(25.935 75+[S]);糖化反應(yīng)的最適pH 值為6.0;在不同溫度下測(cè)定糖化反應(yīng)速率,計(jì)算得到活化能E 為40.966kJ/mol。濃香型大曲糖化酶類的糖化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與單一酶相似,這可能是因?yàn)槊妇哂袑R恍?,以淀粉為底物時(shí),只有糖化酶類起作用。通過(guò)控制淀粉濃度(投糧量)、用曲量、入窖酸度和溫度可以使?jié)庀阈痛笄频奶腔l(fā)酵過(guò)程協(xié)調(diào)進(jìn)行,以提高濃香型大曲酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。

    1 辛磊.白酒微量成分與酒體風(fēng)格特征關(guān)系的探討[J].食品與機(jī)械,2004(2):49~50.

    2 范文來(lái),徐巖.大曲酶系研究的回顧與展望[J].釀酒,2000(3):35~40.

    3 章克昌.酒精與蒸餾酒工藝學(xué)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1995.

    4 王秀奇,秦淑媛,高天慧,等.基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第2版.北京:高等教育出版社,1996:275~276.

    5 天津輕工業(yè)學(xué)院.工業(yè)發(fā)酵分析[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1979:18~20.

    6 李大和,李國(guó)紅,李國(guó)林.淺談濃香型大曲酒入窖發(fā)酵條件與產(chǎn)質(zhì)量的關(guān)系[J].釀酒,2002,29(5):20~24.

    7 任飛,邱聲強(qiáng),韓珍瓊.濃香型大曲酒生產(chǎn)的安全度夏[J].中國(guó)釀造,2011(8):164~166.

    8 王鏡巖,朱圣庚,徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)(上冊(cè))[M].第3版.北京:高等教育出版社,2002.

    9 楊光宇,牟德華,趙廣西,等.趙州雪花梨多酚氧化酶酶學(xué)特性研究[J].食品與機(jī)械,2010,26(5):10~12.

    10 劉洪振,王中林,劉社鋒,等.夏末秋初濃香型大曲酒生產(chǎn)轉(zhuǎn)排的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[J].釀酒科技,1995(3):21~22.

    11 李大和,李國(guó)紅.濃香型曲酒釀造生產(chǎn)工藝要素(四)[J].釀酒,2011,38(1):81~87.

    12 鐘穗生,劉生玉,張林香.馬鈴薯淀粉糖化動(dòng)力學(xué)的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),1998,13(2):21~25.

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