PD-L2在人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞上的表達(dá)及其生物學(xué)意義

張思英,張佳倫

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校,山東菏澤274500)

PD-L2在人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞上的表達(dá)及其生物學(xué)意義

張思英,張佳倫

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校,山東菏澤274500)

目的探討PD-L2在人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞黏附和遷移過程中的生物學(xué)意義。方法應(yīng)用消化法分離、培養(yǎng)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，體外擴(kuò)增培養(yǎng)3代后用于實(shí)驗(yàn)；RT-PCR檢測(cè)PD-L2在人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞上的表達(dá)；應(yīng)用化學(xué)合成的PD-L2 siRNA阻斷PD-L2在人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞上的表達(dá)；細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附能力；Transwell法檢測(cè)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)PD-L2分子，PD-L2 siRNA能有效阻斷人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)PD-L2的表達(dá)；細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，接種后0.5 h阻斷組人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附率與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著升高，在接種后1 h和3 h，阻斷組人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附率均明顯高于正常對(duì)照組；Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，在DMEM-LG、含SDF-1α的DMEM-LG、人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清三種培養(yǎng)條件下，阻斷組細(xì)胞遷移率均顯著降低。結(jié)論P(yáng)D-L2表達(dá)在人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，且在人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附和遷移中發(fā)揮重要作用。

人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；PD-L2；黏附；遷移

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，能在體外向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等多種組織細(xì)胞分化，使其有望應(yīng)用于臨床組織修復(fù)。此外，MSCs能夠抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、DCs的增殖及功能[1]，提示MSCs有望用于預(yù)防移植物抗宿主病(graftversus-host disease,GVHD），提高器官移植的成功率。目前能夠從臍血、肌肉、軟骨等骨髓外組織中成功分離MSCs，但是數(shù)量相對(duì)較少。胎盤作為MSCs的來源容易獲取，不涉及倫理學(xué)問題，且胎盤MSCs的細(xì)胞表型及免疫功能均與骨髓MSCs相似[2]，成為MSCs的理想來源。研究表明，MSCs經(jīng)血管全身輸注后，能穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞向靶組織遷移。在此過程中MSCs表達(dá)的黏附分子[3]、趨化因子[4]、生長(zhǎng)因子[5]以及蛋白酶參與介導(dǎo)了MSCs的黏附和遷移。此外，MSCs亦表達(dá)負(fù)性共刺激分子，如PD-L1[6]、B7H4[7]，但其生物學(xué)功能尚不清楚。

PD-L2與PD-L1同為PD-1（programmed death-1）的配體，通過PD-1/PD-Ls途徑作用于T淋巴細(xì)胞，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖以及對(duì)細(xì)胞因子的分泌，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要作用[8]。目前，對(duì)于PD-L2在hPMSCs上的表達(dá)情況，以及其在hPMSCs的黏附、遷移和免疫功能中的作用尚不清楚。鑒于此，本研究采用化學(xué)合成的siRNA阻斷PD-L2的基因表達(dá)，探討其在hPMSCs的黏附和遷移過程中的生物學(xué)意義?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料低糖DMEM培養(yǎng)基（DMEM-LG）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，Ⅳ型膠原酶為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，PE或FITC標(biāo)記的鼠抗人CD34、CD4、CD8、CD14、CD25、CD44、CD45、CD69、CD105、CD166單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PD-L2 siRNA、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自南通百奧邁科公司，Trizol為上海生工生物產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒購(gòu)自加拿大Fermentas公司。

1.2方法

1.2.1 hPMSCs分離、培養(yǎng)和鑒定胎盤組織來自健康足月產(chǎn)婦，供者知情同意。參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]進(jìn)行hPMSCs分離培養(yǎng)，將胎盤去除絨毛膜、羊膜和蛻膜組織，PBS緩沖液反復(fù)沖洗，洗凈殘留血液。將胎盤組織剪碎后加入1%Ⅳ型膠原酶，37℃消化30min，過100目篩、研磨、收集細(xì)胞，1500 r/min離心5min，PBS緩沖液洗滌兩次，加入DMEM-LG重懸細(xì)胞，調(diào)整合適濃度后接種于6板孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。3 d半量換液，去除未貼壁的懸浮細(xì)胞。之后每3～4 d更換培養(yǎng)基，7～8 d傳代1次。據(jù)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表面抗原CD34、CD45、CD14、CD44、CD105和CD166的表達(dá)進(jìn)行鑒定，3代以后的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)hPMSCs對(duì)PD-L2的表達(dá)收集培養(yǎng)3代后的hPMSCs，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，加入引物和逆轉(zhuǎn)錄酶，常規(guī)方法合成cDNA。所用引物的序列為：PD-L2上游引物：5'-GTTCCA CATACCTCA AGTCCA AGT-3'，下游引物：5'-TCC CTC ACG TGA GTA TTC CAG AAG-3'。β-actin上游引物：5'-GGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物：5'-GGA AGG TGG ACA GCG AGG-3'。PCR反應(yīng)條件為：94℃2min，94℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，28個(gè)循環(huán)，72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。按2×Taq PCRMasterMix試劑盒說明書取等量cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染收集第4代hPMSCs，調(diào)整合適濃度，接種于6孔板，每孔4×105個(gè)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000說明書操作，將siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，siRNA的終濃度為40pmol/ml，繼續(xù)培養(yǎng)6 h用倒置顯微鏡觀察熒光表達(dá)，F(xiàn)CM檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后48 h RTPCR檢測(cè)PD-L2的表達(dá)。

1.2.4 hPMSCs的黏附能力檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，接種于24孔板。實(shí)驗(yàn)分組為接種后0.5 h、1 h和3 h三個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段分別設(shè)PD-L2阻斷組和正常對(duì)照組。分別于接種后0.5 h、1 h、3 h收集板孔中未貼壁細(xì)胞，入流式管，1000 r/min離心5 min，棄上清，各加入500μL固定液，輕輕混勻后流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

1.2.5 hPMSCs的遷移能力檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，DMEM-LG重懸細(xì)胞，接種于Transwell板上室，每室1×105個(gè)細(xì)胞、100μL DMEM-LG；Transwell板下室分別加入600μL DMEM-LG、含SDF-1α(10ng/ mL)的DMEM-LG、hPMSCs正常培養(yǎng)上清。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組為DMEM-LG組、含SDF-1α的DMEM-LG組、hPMSCs培養(yǎng)上清組，三種培養(yǎng)條件組分別設(shè)PD-L2阻斷組和正常對(duì)照組。培養(yǎng)4 h后觀察并收集Transwell板各孔下室中細(xì)胞，1000 r/ min離心5min，加入固定液(每管500μL)懸起細(xì)胞，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPAA13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 hPMSCs的鑒定結(jié)果原代分離培養(yǎng)3 d后，鏡下可見單個(gè)生長(zhǎng)的細(xì)胞，1周后形成散在的梭形貼壁細(xì)胞克隆(圖1-ⅠA)，培養(yǎng)兩周時(shí)，貼壁細(xì)胞克隆明顯增多，可見成簇的成纖維狀細(xì)胞生長(zhǎng)(圖1-ⅠB)，至4周時(shí)，大量增殖的細(xì)胞密布整個(gè)板底（圖1-ⅠC）。培養(yǎng)3代之后的細(xì)胞呈規(guī)則長(zhǎng)梭形，均勻貼壁生長(zhǎng)(圖1-ⅠD)。細(xì)胞表面標(biāo)志為CD44+、CD105+、CD166+、CD14-、CD34-和CD45-(圖1-Ⅱ)，與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致。

圖1 h PMSCs的形態(tài)及表型特征

2.2 hPMSCs對(duì)PD-L2的表達(dá)siRNA轉(zhuǎn)染后24 h，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，PD-L2高表達(dá)于hPMSCs（圖2）。

圖2：hPMSCs高表達(dá)PD-L2

圖3：siRNA的轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后24 h RT-PCR檢測(cè)PD-L2在hPMSCs上的表達(dá)(Ⅰ)：siRNA轉(zhuǎn)染后6 FAM檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；(Ⅱ)：a：PD-L2正常對(duì)照組；b：PD-L2阻斷組；

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果熒光顯微鏡下觀察可見大量綠色熒光表達(dá)。轉(zhuǎn)染效率為80.24%（圖3-Ⅰ）。化學(xué)合成的siRNA能有效阻斷PD-L2的基因表達(dá)(圖3-Ⅱ)。

2.4阻斷PD-L2的表達(dá)后hPMSCs的黏附能力的影響?zhàn)じ铰蕶z測(cè)顯示，接種后0.5 h，阻斷組細(xì)胞的黏附率與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異；在接種后1 h和3 h，阻斷組細(xì)胞的黏附率明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）（圖4）。表明共刺激分子PD-L2在hPMSCs的黏附過程中發(fā)揮重要作用。

2.5阻斷PD-L2的表達(dá)后hPMSCs的遷移能力減弱Transwell檢測(cè)結(jié)果表明，三種培養(yǎng)條件下，阻斷組細(xì)胞的遷移率均顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.01)(圖5)。表明共刺激分子PD-L2參與介導(dǎo)hPMSCs的遷移。

圖4 PD-L2阻斷對(duì)hPMSCs黏附能力的影響

圖5：PD-L2阻斷對(duì)hPMSCs遷移能力的影響

3討論

MSCs為多潛能干細(xì)胞，能向多種組織細(xì)胞分化，且具有自我更新能力，使其有望成為修復(fù)損傷組織的良好種子細(xì)胞。MSCs能夠從多種骨髓外組織中成功分離。我們從人胎盤組織中成功分離出的MSCs，具有和諸多報(bào)道中的MSCs相似的表面標(biāo)志以及多向分化能力。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法能將化學(xué)合成的siRNA成功轉(zhuǎn)入hPMSCs，并有效阻斷PD-L2的基因表達(dá)，而且轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)能力不產(chǎn)生負(fù)面影響。

研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有顯著的遷移能力[6]，經(jīng)全身輸注后能夠向多種組織發(fā)生遷移[10]。目前MSCs已用于臨床治療組織損傷，如糖尿病并發(fā)的氣性壞疽。MSCs進(jìn)入血流之后，首先與血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密接觸，然后遷移至內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)并最終到達(dá)損傷組織[11]。研究顯示，人骨髓MSCs（hBMSCs）、hPMSCs和臍血MSCs（hUCMSCs）的遷移能力存在差異。在既定條件下，hBMSCs和hPMSCs的遷移能力分別是hUCMSCs的5.9倍和3.2倍[12]。MSCs表達(dá)的多種蛋白參與介導(dǎo)其遷移，如組織蛋白酶B、D能增強(qiáng)hUCMSCs的遷移能力。而纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)參與抑制hUCMSCs的遷移。Brooke等[13]人研究發(fā)現(xiàn)，hBMSCs和hPMSCs均在mRNA水平上表達(dá)CD54（ICAM-1）、E-cadherin、CD166（ALCAM）、CD56（NCAM）、CD106（VCAM-1）等分子。此外，CCR7、CCR8、CCR10、CCR11、CXCR4和CXCR6亦表達(dá)于hBMSCs和hPMSCs。這些分子在hBMSCs和hPMSCs黏附和遷移過程中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明，hPMSCs高表達(dá)PD-L2，阻斷PD-L2的表達(dá)后，hPMSCs的黏附能力增強(qiáng)。提示PD-L2參與調(diào)節(jié)hPMSCs的黏附。在hPMSCs的遷移方面，不同培養(yǎng)條件下，hPMSCs的遷移能力存在明顯的差異，hPMSCs培養(yǎng)上清組中hPMSCs的遷移率高于DMEM組、含SDF-1α的DMEM組，可能因?yàn)閔PMSCs培養(yǎng)上清中含有hPMSCs遷移所必需的多種細(xì)胞因子，如CCR1、CCR8、CCR11和CCR6的相應(yīng)配體。阻斷PD-L2在hPMSCs上的表達(dá)后，各培養(yǎng)組細(xì)胞的遷移率均顯著降低，表明PD-L2參與介導(dǎo)了hPMSCs的遷移。

為了探討PD-L2影響hPMSCs遷移的可能機(jī)制，我們觀察了SDF-1α的存在對(duì)hPMSCs的遷移有何影響。結(jié)果顯示，SDF-1α組hPMSCs的遷移數(shù)量多于DMEM組細(xì)胞，阻斷PD-L2的表達(dá)后，hPMSCs的遷移率顯著降低。這表明，hPMSCs在CXCR4的配體SDF-1α的作用下發(fā)生了定向遷移，而且PDL2的阻斷對(duì)hPMSCs沿SDF-1α/CXCR-4軸向遷移產(chǎn)生重要影響，但其中具體的機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，hPMSCs高表達(dá)共刺激分子PD-L2，通過siRNA阻斷PD-L2的基因表達(dá)后，hPMSCs的黏附力增強(qiáng)遷移力明顯減弱。說明PD-L2作為PD-1的受體對(duì)于hPMSCs的黏附和遷移具有重要意義。為hPMSCs的負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制的研究以及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

[1]Lee YS,Won KJ,Park SW,et al.Mesenchymal stem cells regulate the proliferation of T cells via the growth-related oncogene/CXC chemokine receptor,CXCR2[J].Cell Immunol,2012，279(1)：1-11.

[2]古彥錚，薛群，王泳，等．人胎盤源與人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性的比較及負(fù)性協(xié)同刺激分子PD-L1的表達(dá)[J]．中國(guó)免疫學(xué)雜志，2009，25(5)：387-401．

[3]Zhu H,Mitsuhashi N,Klein A,et al.The role of the hyaluronan receptor CD44 inmesenchymal stem cellmigration in the extracellular matrix[J].Stem Cells,2006，24(4)：928-935.

[4]Xie J,WangW,Si JW,et al.Notch signaling regulates CXCR4 expression and themigration ofmesenchymal stem cells[J].Cell Immunol,2013，281(1)：68-75.

[5]Vogel S,Peters C,Etminan N,et al.Migration ofmesenchymal stem cells towards glioblastoma cells dependson hepatocyte-growth factor and is enhanced by aminolaevulinic acid-mediated photodynamic treatment[J].Biochem Biophys Res Commun,2013，431(3)：428-432.

[6]Sheng H,Wang Y,Jin Y,etal.A critical role of IFNgamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through upregulation ofB7-H1[J].CellRes,2008，18(8)：846-857.

[7]Xue Q,Luan XY,Gu YZ,et al.The negative co-signalingmolecule b7-h4 is expressed by human bone marrow-derived mesenchymal stem cellsandmediates its T-cellmodulatory activity[J].Stem Cells Dev,2010，19(1)：27-38.

[8]MessalN,SerriariNE,Pastor S,etal.PD-L2 isexpressed on activated human T cells and regulates their function[J].Mol Immunol, 2011，48(15-16)：2214-2219.

[9]欒希英，劉同慎，曹奇志.人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞周期及其活化的抑制作用研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，21(18)：3142-3145.

[10]Lin MN,Shang DS,SunW.Involvement of PI3K and ROCK signaling pathways in migration of bone marrow-derived mesenchymal stem cells through human brainmicrovascularendothelial cellmonolayers[J].Brain Res,2013，1513：1-8.

[11]Nourshargh S,Marelli-Berg FM.Transmigration through venular walls：a key regulator of leukocyte phenotype and function[J]. Trends Immunol,2005，26(3)：157-65.

[12]Li G,Zhang XA,Wang H,et al.Comparative proteomic analysis of mesenchymal stem cells derived from human bonemarrow,umbilical cord and placenta：implication in themigration[J].Adv Exp Med Biol,2011，720：51-68.

[13]Brooke G,Tong H,Levesque JP,et al.Molecular traffickingmechanisms ofmultipotentmesenchymal stem cells derived from human bonemarrow and placenta[J].Stem CellsDev,2008，17(5)：929-940.

PD-Betw een L2 In Hum an Placen ta M esenchym al Stem Cells On The Exp ression And Its Biological Significance

Zhang Siying,Zhang Jialun
(Hezemedicalcollege,Heze 274500,Shandong)

ObjectiveDiscussed the PD-between L2 in human placentamesenchymalstem celladhesion andmigration in the process of biological significance.MethodsThe digestion method between placentamesenchymal stem cellswere isolated and cultured,in vitro amplification culture after three generationsused in experiments.RT-PCR detection of PD-between L2 in human placentamesenchymal stem cellson the expression of application of chemical synthesis of PD-L2 siRNA blocking between PD-L2 in human placentamesenchymal stem cells on the expression of Cell countingmethod to detecthuman placentaadhesion ability ofmesenchymalstem cells.Transwellmethod to detecthuman placentamesenchymal stem cells'ability to m igrate.ResultsThe placentalmesenchymal stem cells between high expression PD-L2molecules,PD-L2 siRNA can effectively block between placentamesenchymal stem cells in PD-the expression of L2.Cell count,according to the resultsof vaccination after 0.5 h block group between placenta adhesion rate ofmesenchymalstem cells compared w ith normal controlgroup no significantincreases,in the 1 h and 3 h after inoculation,blocking group between placenta adhesion rate of mesenchymal stem cellswere significantly higher than normal control group; Transwell test results showed that compared w ith normal control group,in DMEM-LG,DMEM containing alpha SDF-1-LG,people between the placentamesenchymal stem cell culture supernatantof three conditions,cellmobility of blocking group were significantly reduced.ConclusionThe PD-between L2 expression in human placenta mesenchymal stem cells,and between the peopleof the placentaadhesion andmigration of mesenchymalstem cellsplay an important role.

human placentamesenchymalstem cells;PD-L2;Adhesion;the migration

R392.2

：A

：1008-4118（2013）02

10.3969/j.issn.1008-4118.2013.02.

2013-05-08