從千金子中提取高純度千金子甾醇的工藝研究

李玉山 王經(jīng)安

（陜西惠豐制藥有限公司，長(zhǎng)武 713600）

千金子為大戟科植物續(xù)隨子（Euphorbia IathyrisL.）的干燥成熟種子，又名千兩金、菩薩豆、續(xù)隨子、拒冬實(shí)、聯(lián)步、拒冬子、灘板救、看園老、百藥解、干金藥解、小巴豆。主要分布于我國(guó)華東、華中、華南、西南及陜西等地。種子含油48%～50%，油中含多種脂肪酸，主要有油酸89.2%，棕櫚酸5.5%，亞油酸0.4%，亞麻酸0.3%等，油中還含菜油甾醇，豆甾醇，β－谷甾醇，千金子甾醇，巨大戟萜醇－20－棕櫚酸酯，7－羥基－千金藤醇－二乙酸－二苯甲酸酯，巨大戟萜醇 －1－H－3，4，5，8，9，13，14－七去氫 －3－十四酸酯、千金藤醇 －3，15－二乙酸 －5－苯甲酸酯、千金藤醇－3，15－二乙酸－5－煙酸酯，巨大戟萜醇－3－棕櫚酸酯，17－羥基巖大戟－15，17－二乙酸－3－O－桂皮酸酯，17－羥基－異千金藤醇－5，15，17－三－O－乙酸－3－O－苯甲酸酯，7－羥基千金藤醇－5，15－二乙酸－13－苯甲酸酸－7－煙酸酯及三十一烷醇等。種子還含瑞香素，馬栗樹(shù)皮苷，千金子素及異千金子素。千金子中的瑞香素油抗炎鎮(zhèn)靜及抑菌作用，七葉樹(shù)苷有瀉下逐水利尿作用，破血通經(jīng)等生理活性和功效。用于治療水腫、疾飲、積滯脹滿(mǎn)、二便不通、血瘀閉經(jīng)、毒蛇咬傷、晚期血吸蟲(chóng)病腹水等，外治頑癬、疣贅［1］。種子中主含脂肪油，香豆素類(lèi)及甾醇類(lèi)成分，具有逐水消腫，破血散結(jié)功效。最近研究報(bào)道有治療白血病、食管癌、皮膚癌、疣贅、抗腫瘤及美白作用［2－3］。千金子中脂肪油的含量高達(dá) 50%以上［4－5］，油中含千金子甾醇，能刺激腸管產(chǎn)生腹瀉，具有導(dǎo)瀉作用，其程度為蓖麻油的3倍［6］。千金子甾醇化學(xué)名為千金二萜醇二乙酸酯苯酸酯。房子婷等［7］研究表明具有抑制黑色素生成，去祛斑，除色素，美白功效。本試驗(yàn)研究千金子甾醇的提取純化工藝，以期為千金子的開(kāi)發(fā)利用提供借鑒。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

千金子：成都荷花池藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地陜西寧強(qiáng)；對(duì)照品：Sigma公司；甲醇，石油醚（60～90℃），乙酸乙酯均為分析純。

R－201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申科機(jī)械研究所；BS1101型電子分析天平：北京賽多利斯儀器公司；101－2－BS電熱真空烘箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療有限公司；Waters 486高效液相色譜儀：美國(guó)；LYZX24型低溫螺旋榨油機(jī)：鄭州企鵝糧油機(jī)械有限公司。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 千金子甾醇的高效液相檢測(cè)條件

色譜條件：以Nova－PaRC18 Column（150 mm×4.6 mm×5μm）為固定相，甲醇∶水 ＝100∶4（V／V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速1.0 mL／min，進(jìn)樣量20μL。

1.2.2 含油量的測(cè)定

按GB 10359—1989方法進(jìn)行。

1.2.3 水分的測(cè)定

按GB 10358—1989方法進(jìn)行。

1.3 提取工藝流程

提取工藝流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 提取次數(shù)的影響

千金子中含油較高，采用冷榨法榨油得到粗油，油中含有較多雜質(zhì)，用石油醚萃取，餅粕和油渣再用石油醚提取，萃取的石油醚用純化水反萃取出其中的水溶性成分，達(dá)到進(jìn)一步除雜目的。石油醚用干燥劑脫水后再經(jīng)柱色譜，得到高純度千金子甾醇。

1.4 冷榨出油工藝研究

1.4.1 冷榨工序

LYZ×24型低溫螺旋榨油機(jī)，入榨料溫43～53℃，水分8%左右，進(jìn)料時(shí)先少后多，逐漸加量，禁止下料過(guò)快，不斷捅料門(mén)，防止斷料，斷料時(shí)間或停機(jī)時(shí)間一般不超過(guò)10 min，主電機(jī)配置變頻器，榨油機(jī)先調(diào)速至15 r／min，待溫度上升至60℃時(shí)，調(diào)至11 r／min，并分2～3次把餅粕厚度調(diào)至10 mm左右，主機(jī)電流40～45 A。

1.4.2 冷榨工藝指標(biāo)優(yōu)化

以原料溫度分別為20、24、28℃考察了餅粕殘油率，餅粕含水量，出餅溫度。

1.5 餅粕提取工藝研究

由于餅粕仍殘留有效成分，故需用溶劑浸出，以等量（V／m）石油醚（60～90℃）提取，對(duì)主要提取影響因素，提取時(shí)間，提取次數(shù)，提取溫度，餅粕水分含量進(jìn)行了考察。

1.5.1 提取次數(shù)的影響

以等量（V／m）石油醚在60℃下提取1 h，分別提取1、2、3、4次，烘干濾餅，測(cè)定濾餅殘油率。

1.5.2 提取時(shí)間的影響

以等量（V／m）石油醚在60℃下分別提取1、2、3、4 h，烘干濾餅，測(cè)定濾餅殘油率。

1.5.3 餅粕含水量的影響

以含水量分別為4%、6%、8%的餅粕在60℃下分別提取1 h，烘干濾餅，測(cè)定濾餅殘油率。

1.6 萃取與反萃取工藝研究

1.6.1 冷榨油的萃取

由于冷榨出油中含有大量雜質(zhì)，需要進(jìn)一步去除，達(dá)到初步純化的目的，為下一步的分離純化減輕負(fù)擔(dān)，故需用低極性溶劑對(duì)榨出的油進(jìn)行萃取，本試驗(yàn)采用60～90℃石油醚對(duì)榨出的油進(jìn)行萃取，以萃取劑用量，萃取時(shí)間，萃取溫度，萃取次數(shù)為考察對(duì)象，以萃取液中的千金子甾醇的含量（mg／mL）為考察目標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化（表1）。

表1 試驗(yàn)因素水平表

1.6.2 石油醚的反萃取

主要是用水洗去石油醚中的親水性雜質(zhì)，達(dá)到進(jìn)一步除雜目的。由于該步驟主要采用水反萃取，因此對(duì)于工藝的要求不是很?chē)?yán)格，可參照萃取過(guò)程的優(yōu)化工藝。

1.7 柱色譜工藝研究

為了得到高純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%以上）的千金子甾醇，柱色譜是必需的，對(duì)柱色譜中的填料，不同流動(dòng)相配比，不同流速，色譜柱不同高度與直徑比（高徑比），不同柱溫對(duì)洗脫液中千金子甾醇的含量（mg／mL）及回收率（%）的影響進(jìn)行了考察。

2 結(jié)果與討論

2.1 冷榨出油工藝

原料經(jīng)一次壓榨，餅粕成瓦塊狀，內(nèi)面光滑無(wú)油跡，呈棕褐色，背面有裂紋開(kāi)口，快速向內(nèi)翻卷，冷后變脆。餅溫60℃左右。冷榨工序工藝指標(biāo)見(jiàn)表2。

表2 冷榨工藝指標(biāo)

低溫冷榨不需油料先脫皮、蒸炒、粉碎及后期復(fù)雜的凈化處理，成功解決了需在低溫壓榨的油料壓榨困難的問(wèn)題，采用物理低溫工藝，使得在高溫下易破壞的成分得到了很好的保護(hù)，而千金子甾醇含有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，不耐高溫，因此很適合低溫冷榨，一次壓榨后餅粕殘油率為14.2%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.8%，低溫冷榨明顯有利于熱敏性油脂的浸出。

2.2 餅粕殘油率

2.2.1 提取次數(shù)的影響

由圖2可知，隨提取次數(shù)的增加，餅粕中的殘油率也下降，但提取3次和4次餅粕中的殘油率無(wú)明顯變化。冷榨餅粕由于采用壓力較高的冷榨機(jī)壓榨，形成的餅粕質(zhì)地致密，分子間孔隙很小，溶劑難于滲入，難于浸出有效成分，必須增加提取次數(shù)，考慮到餅粕中殘油率不太高，因此采用3次提取即可。

圖2 提取次數(shù)的影響

2.2.2 提取時(shí)間的影響

由圖3可知，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，餅粕中的殘油率也下降，但下降的不明顯。冷榨餅粕中有效成分比一般物料難提出，需要較長(zhǎng)時(shí)間的提取才能達(dá)到濃度平衡，考慮到實(shí)際情況浸取3h即可。

圖3 提取時(shí)間的影響

2.2.3 餅粕含水量的影響

由圖4可知，隨餅粕含水量的增加，餅粕中的殘油率也略有增加，但很微弱。一般認(rèn)為原料中含水量越大，用低極性溶劑提取時(shí)對(duì)浸出物含有較大影響，然而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)餅粕水分對(duì)浸出影響甚微，而且若在壓榨中物料濕度過(guò)低，會(huì)增加物料黏度，反而對(duì)浸出不利，因此餅粕的含水量對(duì)提取的影響可不考慮。

圖4 餅粕含水量的影響

2.3 萃取與反萃取工藝

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)表

由表3可知，影響因素的主次分別為：A→D→C→B，最佳工藝成為：A3B3C3D3。即：3倍量（V／V）石油醚60℃下萃取0.5h，萃取3次。在此工藝下進(jìn)行了3次工藝驗(yàn)證，殘液中殘油率分別為：1%，2%，3%，平均殘油率為2.1%。

2.4 柱色譜工藝

由表4可知：以中性氧化鋁為填料，洗脫液中有效成分及回收率均高于基他填料，硅膠稍次之，但由于氧化鋁再生較困難，實(shí)際選擇硅膠。柱色譜中分離效果好壞很大程度上取決于色譜填料的選擇，但是色譜填料的選擇范圍很寬，要做合適的選擇。

表4 不同填料的影響

由表5可知，石油醚∶乙酸乙酯 ＝3∶1（V／V）的流動(dòng)相的極性較大，洗脫液中雜質(zhì)較多，因此千金子甾醇含量較低，但極性較大，洗脫充分，因此，回收率較高。石油醚∶乙酸乙酯 ＝5∶1或6∶1（V／V）的流動(dòng)相極性較小，洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，而且對(duì)千金子甾醇無(wú)法有效洗脫，因此，不僅千金子甾醇的含量低，而且回收率也低。石油醚∶乙酸乙酯 ＝4∶1（V／V）的流動(dòng)相對(duì)于洗脫千金子甾醇來(lái)說(shuō)，極性合適，洗脫液中千金子甾醇的含量高，回收率也高，是很好的洗脫液。

表5 不同流動(dòng)相的影響

由表6可知，流速越大，洗脫液中千金子甾醇含量降低，回收率降低。由于流速加大，有效成分還沒(méi)來(lái)的及洗脫，洗脫液已流出，不但洗脫效果不好，而且會(huì)浪費(fèi)大量洗脫液，但洗脫時(shí)間較短。流速太低，雖然有效成分能很好洗脫，洗脫液用量也少，但洗脫時(shí)間很長(zhǎng)。從表6中可知流速為5 mL／min時(shí)洗脫液中千金子甾醇含量較高，而且回收率高，因此選擇流速為5 mL／min。

表6 不同流速的影響

由表7可知，色譜柱的高徑比越大，即屬于“細(xì)而長(zhǎng)”的柱子，各種成分隨洗脫液的流動(dòng)能在柱中有效的分開(kāi)，形成不同的色譜段，分離效果較好，但分離時(shí)間很長(zhǎng)。色譜柱的高徑比越小，即屬于“短而粗”的柱子，各種成分隨洗脫液的流動(dòng)不能在柱中很好的分開(kāi)，各種成分易交疊在一起，無(wú)法有效分離。從上表可看出，色譜柱的高徑比為25時(shí)較好。

表7 不同高徑比的色譜柱影響

由表8可知，柱溫是一個(gè)重要的操作變數(shù)，直接影響分離效能和分析速度。柱溫對(duì)組分分離的影響較大，提高柱溫使各組分的揮發(fā)靠攏，不利于分離，所以，從分離的角度考慮，宜采用較低的柱溫。但柱溫太低，被測(cè)組分在兩相中的擴(kuò)散速率大為減小，分配不能迅速達(dá)到平衡，峰形變寬，柱效下降，并延長(zhǎng)了分析時(shí)間。選擇的原則是：在使最難分離的組分能盡可能好的分離的前提下，盡可能采取較低的柱溫，但以保留時(shí)間適宜，峰形不拖尾為度。具體操作條件的選擇應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)際情況而定。柱溫越高，出峰越快，保留時(shí)間越短，有些組份可能分離度不夠.無(wú)法完全分開(kāi)。本試驗(yàn)采用25℃柱溫。

表8 不同柱溫的影響

3 結(jié)論

千金子種子中含有豐富的油脂，利用冷榨制油，入榨溫度以及壓榨過(guò)程中料溫較低，有效地保護(hù)了熱敏性物質(zhì)—千金子甾醇，廢除了傳統(tǒng)的利用低極性溶劑提取油脂的方法，減少了環(huán)境污染。餅粕殘油量較少，可用少量的溶劑提取，極大地減少了有機(jī)溶劑的用量.最佳榨油工藝參數(shù)為：榨油機(jī)轉(zhuǎn)速12 r／min，物料水分在7.2%。該法污染少，能耗低。餅粕最佳提取工藝為：等量石油醚（60～90℃）在60℃下提取2次，每次3 h，經(jīng)冷處理餅粕殘油率僅達(dá)2.1%，粗油的萃取，考慮了萃取劑用量，萃取時(shí)間，萃取溫度，萃取次數(shù)4個(gè)因素考察對(duì)象，采用了L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了優(yōu)化，最佳萃取工藝為：3倍量（V／V）石油醚60℃萃取0.5 h，萃取2次。柱層析以硅膠為填料，對(duì)層析中的各種影響因素進(jìn)行了分析，最桂層析條件為：層析柱高徑比25∶1，填料為硅膠，流動(dòng)相為石油醚：乙酸乙酯 ＝4∶1（V／V），流速5 mL／min，室溫下層析，千金子甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)99.4%，收率達(dá)0.96%。

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