霉菌毒素在肉雞體內(nèi)的殘留及其控制研究

黃曉琳 曲道峰 韓劍眾

(浙江工商大學(xué)食品質(zhì)量安全系浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310035)

霉菌毒素是飼料或谷物中霉菌所產(chǎn)生的次級(jí)有毒代謝產(chǎn)物，在各種食品與飼料中廣泛存在和危害最大的霉菌毒素一般認(rèn)為有黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、赭曲霉毒素 A(Ochratoxin A，OTA)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)、T－2毒素等。霉菌毒素對(duì)人和動(dòng)物具有廣泛的毒性作用，急性中毒會(huì)嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體的健康狀況，并最終導(dǎo)致動(dòng)物死亡；亞急性中毒會(huì)使動(dòng)物的生長受阻，免疫功能受損等；慢性中毒則可能會(huì)引發(fā)腫瘤。飼料霉變產(chǎn)生的霉菌毒素除嚴(yán)重影響畜禽生產(chǎn)性能外，還可造成霉菌毒素在體內(nèi)各組織器官的殘留，進(jìn)而影響動(dòng)物源性食品的安全[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素廣泛存在于牛乳、乳酪、玉米、花生、香料及其他各種飼料與食品中，然而對(duì)于霉菌毒素在體內(nèi)組織器官的殘留研究報(bào)道很少。

對(duì)霉菌毒素及其體內(nèi)殘留控制的方法主要是在飼料中添加霉菌毒素吸附劑[2－3]，常用的有天然鋁硅酸鹽類無機(jī)吸附劑(如膨潤土、沸石、蒙脫石等)和酵母細(xì)胞提取物類有機(jī)吸附劑(如葡甘露聚糖)等，然而目前市場(chǎng)上霉菌毒素吸附劑種類繁多，吸附效果相差很大。本試驗(yàn)采用以改性前后蒙脫石為主要成分的霉菌毒素吸附劑，研究改性前后的蒙脫石在肉雞體內(nèi)對(duì)霉菌毒素的吸附效果，并初步探討其作用機(jī)理，為新型飼料添加劑的開發(fā)研制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

霉菌毒素:利用玉米霉變制備。在30℃、濕度80%條件下，玉米粉含水量20%，每天翻混1～2次，連續(xù)7 d，烘干備用。經(jīng)檢測(cè)，霉變玉米粉含AFB182.36 ng/g，OTA 41.56 ng/g，ZEA 915.4 ng/g。霉變?nèi)占Z是由霉變玉米替代基礎(chǔ)日糧中的正常玉米制成。

試驗(yàn)肉雞:13日齡三黃雞，平均體重216 g左右，余姚格格畜禽養(yǎng)殖有限公司。

霉菌毒素吸附劑A的主要成分是純化的鈉化納米蒙脫石、吸附劑B的主要成分是改性蒙脫石及部分酵母細(xì)胞壁提取物，江西中科聯(lián)合生化營養(yǎng)有限公司。

霉菌毒素由酶聯(lián)免疫試劑診斷盒檢測(cè):山西德豐信成生物科技有限公司；Infinite 200酶標(biāo)儀:瑞士Tecan公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取210只13日齡三黃雞肉仔雞，隨機(jī)分為7組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。正式試驗(yàn)開始時(shí)，先進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)7 d。具體分組如表1。

表1 試驗(yàn)日糧

第20日齡開始飼養(yǎng)試驗(yàn)，試驗(yàn)期為21 d，肉雞平均體重為(344.67±1.53)g，各處理組的日糧配方和營養(yǎng)水平完全相同，見表2。

表2 日糧組成和營養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)試驗(yàn)

水泥地面按飼養(yǎng)要求用尼龍網(wǎng)分隔21組，平養(yǎng)，每組10羽。試驗(yàn)前雞舍、雞籠進(jìn)行徹底清掃，熏蒸消毒；自由采食和飲水，常規(guī)免疫。試驗(yàn)結(jié)束后記錄肉雞最終體重及采食量，計(jì)算料重比。

1.4 肝腎及糞便樣品的采集

肝臟、腎臟采集:每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2只雞，頸靜脈放血致死，經(jīng)正常宰殺，迅速打開腹腔，采集肝臟、腎臟、放入培養(yǎng)皿中用預(yù)冷的生理鹽水清洗干凈，用濾紙擦去多余的液體放入－20℃冰箱保存待測(cè)。

糞便采集:于試驗(yàn)開始第2天，每天以重復(fù)組為單位收集糞便，－20℃保存。將20 d收集的糞樣品混勻，糞樣65℃鼓風(fēng)干燥，粉碎，裝入取樣袋內(nèi)封存待測(cè)。

1.5 霉菌毒素檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定，AFB1、OTA試劑盒的檢測(cè)限為0.1 ng/g，ZEA試劑盒的檢測(cè)限為1 ng/g。

肝臟、腎臟樣品預(yù)處理:稱取5 g勻漿樣品于125 mL具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入60%甲醇水溶液25 mL和20 mL正己烷加塞震蕩10 min，過濾，收集濾液于分液漏斗中，靜置分層；待下層甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一錐形瓶中。吸取10 mL甲醇水提取液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，取10 mL于20 mL蒸發(fā)皿中，65℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入60%甲醇水溶液5 mL，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解。取濾液2 mL，加入6 mL 20%甲醇水溶液，混勻(若渾濁用濾紙過濾)，此為肝臟、腎臟待檢液。糞便樣品前處理:稱取5 g粉碎樣品于100 mL帶塞三角瓶內(nèi)，準(zhǔn)確加入5倍體積60%甲醇/水溶液。將上述帶塞三角瓶放入振蕩器內(nèi)振蕩，充分振蕩3 min，用濾紙過濾，收集濾液。取濾液2 mL，加入2 mL蒸餾水，混勻，此為糞便待檢液，按說明書的方法步驟進(jìn)行測(cè)定肝臟、腎臟及糞便中AFB1、OTA、ZEA的含量，每個(gè)樣品平行2次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)進(jìn)行Duncan多重比較并做顯著性差異檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)試驗(yàn)

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，與對(duì)照比相比，試驗(yàn)組Ⅰ肉雞的生長速度降低，料重比升高(P＞0.05)、試驗(yàn)組Ⅱ肉雞的生長速度顯著降低，料重比顯著升高(P＜0.05)。表明霉菌毒素可嚴(yán)重影響肉雞的生長性能，且隨著毒素含量增加影響越顯著。

添加霉菌毒素吸附劑后，體重與料比均有一定程度的改進(jìn)。從試驗(yàn)結(jié)果看，吸附劑B可有效吸附飼料中的霉菌毒素，改善肉雞生長；吸附劑A有一定的效果，但效果不明顯。無論飼料中霉菌毒素含量水平如何，吸附劑B效果明顯，肉雞體重顯著升高，料重比顯著降低(P＜0.05)；試驗(yàn)組Ⅵ與試驗(yàn)組Ⅱ相比，肉雞體重顯著升高(P＜0.05)，料重比降低(P＞0.05)，與對(duì)照比相比，試驗(yàn)組Ⅴ、Ⅵ的料重比無顯著性差異(P＞0.05)。這表明霉菌毒素吸附劑B有效的阻止了霉菌毒素對(duì)肉雞生長性能的影響。

表3 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

表4 肝、腎及糞便中霉菌毒素的含量

2.2 飼糧不同含量的霉菌毒素在肉雞肝腎內(nèi)的殘留

各試驗(yàn)組的肝、腎的霉菌毒素含量結(jié)果見表4。

由表4可知，對(duì)照組的肉雞肝腎臟中未檢測(cè)出霉菌毒素，而2個(gè)試驗(yàn)組在肝腎均檢出有霉菌毒素殘留。與飼料中的毒素含量相比，試驗(yàn)Ⅰ組3個(gè)霉菌毒素在內(nèi)臟中的殘留分別為20.52%、9.5%和6.03%(肝)；10.40%、23.01%和 4.43%(腎)；飼料中霉菌毒素含量較高的試驗(yàn)Ⅱ組，其在體內(nèi)的殘留則高達(dá) 18.94%、8.89%和4.50%(肝)；9.47%、21.88%和4.00%(腎)。

2.3 霉菌毒素吸附劑的作用效果

試驗(yàn)結(jié)果表明，霉菌毒素吸附劑均可有效降低肉雞內(nèi)臟中的霉菌毒素的殘留，與未加吸附劑組比較，飼料中較低含量時(shí)，霉菌毒素吸附劑A對(duì)試驗(yàn)肉雞肝腎的霉菌毒素含量分別下降了AFB137.48%、OTA 68.38%和 ZEA 14.3%(肝)；AFB124.90%、OTA 18.73%和ZEA 30.98%(腎)；飼料中含有較高霉菌毒素時(shí)，則分別下降了 40.64%、8.74%、15.87%(肝)；30%、37.11%、17.79%(腎)。霉菌毒素吸附劑B的吸附效果明顯高于吸附劑A，添加后，試驗(yàn)肉雞內(nèi)臟的霉菌毒素含量下降幅度大幅增大。飼料中較低含量時(shí)，分別下降了63.91%、100%和42.06%(肝)；52.14%、46.99%和 64.99%(腎)；飼料中含有較高的霉菌毒素時(shí)分別下降了63.72%、32.79%和 39.81%(肝)；52.05%、53.33%和54.34%(腎)。

2.4 吸附劑對(duì)霉菌毒素排泄的影響

霉菌毒素吸附劑的作用主要是通過體內(nèi)對(duì)霉菌毒素的吸附，并排出體外。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，飼料添加吸附劑后，試驗(yàn)組肉雞糞便中的霉菌毒素含量都有不同程度的升高。與未添加組比較，使用吸附劑A后，糞便中的霉菌毒素含量分別為37.77%、33.06%和 38.31%(飼料低含量組)；54.64%、47.80%和44.35%(飼料高含量組)。吸附劑B的吸附效果從糞便中排出的霉菌毒素含量看，也證明其吸附效果高于吸附劑A，與使用吸附劑A比較，排出的霉菌毒素含量分別增加50.22%、20.39%和46.98%(飼料低含量組)；29.20%、17.34%和40.87%(飼料高含量組)。

3 討論與結(jié)論

霉菌毒素影響畜禽生長和采食量。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，肉仔雞在飼喂霉菌毒素后體重顯著下降，料肉比顯著升高，添加霉菌毒素吸附劑后，各項(xiàng)性能指標(biāo)得到明顯改善。

黃曲霉毒素被動(dòng)物攝入后，迅速由胃腸道吸收，經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟，在攝食后0.5～1 h，肝內(nèi)毒素濃度達(dá)到最高水平。研究表明動(dòng)物接觸的日糧中AFB1含量超過20 ng/g，可在肝臟等內(nèi)臟及畜產(chǎn)品中殘留，其中在肝臟中殘留最多[4]。在有關(guān)豬的相關(guān)研究中[5]，飼喂含 AFB113.52～80μg/kg的飼料，豬的肝臟、腎臟中 AFB1含量分別為 1.27～1.43 ng/g、2.19～3.44 ng/g。本試驗(yàn)結(jié)果表明，肉雞與豬類似，日糧中的黃曲霉毒素進(jìn)入肉雞體內(nèi)后，在肝臟、腎臟中均有一定程度的蓄積，且肝臟中的殘留量高于腎臟，與上述報(bào)道一致。國標(biāo)規(guī)定，新鮮豬組織中AFB1的含量不得超過0.5 ng/g，歐盟則不得超過0.05 ng/g。本研究表明，無論低劑量組還是高劑量組的肝、腎中黃曲霉毒素已超標(biāo)。

已有研究表明，無論飼料中OTA的含量多少，均會(huì)轉(zhuǎn)移到動(dòng)物源性食品中，特別是是腎臟，一般認(rèn)為在體內(nèi)的殘留分布及量為腎臟＞肝臟＞肌肉＞脂肪[6]。即使是被認(rèn)為健康的屠宰豬，其血液及可食組織中均含有OTA分別為血清2.5～33.3 ng/g，腎臟 1.3～22.0 ng/g，肝臟1.2～19.5 ng/g[7]。本研究結(jié)果表明，雞也一樣，即使是低水平的赭曲霉毒素日糧，也會(huì)在腎臟及肝臟中殘留，在腎臟中的殘留量高于肝臟。然而目前在國內(nèi)還沒有規(guī)定動(dòng)物可食組織中OTA的殘留標(biāo)準(zhǔn)。

ZEA通過被污染的谷物和肉、奶等制品進(jìn)入人體。ZEA及其代謝物主要在肝臟中殘留[8]，James L J等[9]給豬飼喂ZEA污染日糧(40 mg/kg)4周，肝臟中ZEA的濃度為78～128μg/kg。Mirocha C J等[10]報(bào)道小雞采食含ZEA 100 mg/kg的日糧8 d，肝臟中ZEA達(dá)681μg/kg。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，肉雞采食457.7 μg/kg日糧20 d，肝臟中 ZEA含量達(dá)18μg/kg，與上述報(bào)道相符。然而對(duì)于ZEA在動(dòng)物可食組織中的含量標(biāo)準(zhǔn)不僅在我國甚至在歐盟一些發(fā)達(dá)國家都沒有作出明確規(guī)定。

目前，對(duì)飼料中霉菌毒素的控制主要是采用所謂的霉菌毒素吸附劑，盡管品種繁多，但主要成分則是大多為蒙脫石(改性)及酵母細(xì)胞壁提取物等。本試驗(yàn)的吸附劑A的主要成分是純化的鈉化納米蒙脫石，吸附劑B的主要成分是改性蒙脫石及部分酵母細(xì)胞壁提取物。關(guān)于蒙脫石的理化特性、吸附作用和在畜牧養(yǎng)殖中應(yīng)用已有許多報(bào)道[11－14]。本研究表明，蒙脫石可降低AFB1、OTA、ZEA在肉雞肝臟、腎臟的殘留，提高霉菌毒素的排出率，但作用效果明顯不如改性后的作用效果。對(duì)蒙脫石表面基團(tuán)或電荷分布進(jìn)行適當(dāng)改性處理之后，使其表面形成多個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)，獲得新的理化特征，大幅度提高吸附能力，不僅提高對(duì)AFB1的吸附，同時(shí)改善其對(duì)ZEA和OTA等極性較低毒素的吸收。

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