南瓜中甘油糖脂分離制備及體外抗腫瘤活性研究

蔣志國 王燕華 鐘秋平 張海德

（海南大學(xué)食品學(xué)院1，?？?570228）

（海南大學(xué)信息學(xué)院2，?？?570228）

南瓜屬作物（Cucurbita）為葫蘆科南瓜屬的世界性蔬菜，在中國栽培十分普遍。隨著人民飲食結(jié)構(gòu)的改善和對南瓜營養(yǎng)成分保健價值深入的研究，南瓜越來越受到重視，其栽培面積、單產(chǎn)及總產(chǎn)量迅速增長。近幾年南瓜產(chǎn)業(yè)在海南發(fā)展迅速，2008年種植面積為12萬畝，2009年為15萬畝，2010年達20萬畝，位居海南省蔬菜栽培面積的第4位，已成為海南冬季北運瓜菜的主要種類之一［1］。充分利用海南省豐富的南瓜資源，提高農(nóng)產(chǎn)品附加值，不斷挖掘其新的利用價值和應(yīng)用領(lǐng)域，具有重要的現(xiàn)實意義。

南瓜的諸多營養(yǎng)保健功能早已為人們所熟知，如降血糖血壓、調(diào)血脂，防治動脈硬化等［2－3］。迄今為止，有關(guān)南瓜中活性成分的分離提取，研究者主要關(guān)注的是南瓜中的多糖，但對其中小分子甘油糖脂的分離提取、結(jié)構(gòu)鑒定以及活性研究還未見報道。作為細胞膜的重要組成部分，甘油糖脂具有抗氧化［4－5］、抗病毒［6］、抗炎［7－9］、抗腫瘤［10－13］等多種生物活性。甘油糖脂有效成分的制備分離是進一步研究分子結(jié)構(gòu)、生物活性及構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)，盡管目前己有多種有效成分的提取分離方法，如高效薄層層析法、柱層析法等，但都不同程度地存在著提取時間長、提取過程繁瑣、分離純化困難等不足［14］。

本研究擬采用高速逆流色譜分離技術(shù)與制備型高效液相相結(jié)合的方法，以南瓜（Cucurbita moschata）為原料，探索出一套完整的天然產(chǎn)物中有效成分甘油糖脂的提取、分離、純化的工藝。進而研究其抗腫瘤活性，闡明其構(gòu)效關(guān)系，以期為進一步開發(fā)利用南瓜資源提供試驗依據(jù)，提高農(nóng)產(chǎn)品附加值。

1 材料與方法

1.1 材料

南瓜（Cucurbita moschata）：海南儋州。小鼠黑色素瘤B16－F10細胞和人結(jié)腸癌COLO205細胞：中科院上海細胞庫。

DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶（trypsin）：Gibco公司；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑藍（3－［4，5－Dimethylthiazol－2－yl］－2，5－diphenylte trazolium bromide，MTT）：美國 Sigma公司；D4020型大孔吸附樹脂：天津南開大學(xué)化工廠；乙腈（色譜純）：德國Merk公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

HSCCC－D1200高速逆流色譜儀：浙江工商大學(xué)食品與生物工程研究所；K－1800恒流泵：德國Knauer公司；BSZ－100自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠；Model 8823A－UV紫外檢測器：北京新技術(shù)應(yīng)用研究所。聚四氟乙烯螺旋管纏繞在5個水平軸上形成螺旋管（5 mm I.D.柱容積1 200 mL），轉(zhuǎn)速0～1 000 r／min；ZQ2000質(zhì)譜檢測器：美國 Waters公司；Unity INOVA300，500高分辨核磁共振波譜儀：美國Varian公司；LC－20A分析型HPLC：日本Shimadzu公司；LC－29103制備型 HPLC：日本 JAI公司；ROTARY VACUUM EVAPORATOR N－1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；GF254鋁膜 TLC板：德國Merck公司。Shellab Model 2300型CO2培養(yǎng)箱：Sheldon Manufacturing公司；DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀：華東電子管廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

將冷凍干燥南瓜果肉粉15 kg用95%甲醇常溫浸提3次，每次甲醇用量50 L，并不斷攪拌。合并浸提液，減壓濃縮至無醇味后，將浸膏物分散于5 L蒸餾水中，依次用等體積氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，萃取液減壓濃縮后分別得到氯仿浸提物350 g、乙酸乙酯浸提物80 g和正丁醇浸提物100 g。

1.3.2 大孔吸附樹脂柱色譜分離

南瓜氯仿浸提物350 g上樣后，依次用蒸餾水、30%甲醇、60%甲醇、和90%甲醇洗脫，每次3個柱體積，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥后得60%甲醇洗脫部分（Fr60）6.4 g，待用。

1.3.3 HSCCC溶劑系統(tǒng)的選擇

將樣品溶解于不同溶劑系統(tǒng)中，劇烈振蕩后靜置分層，測定其分層時間。用毛細管取近似等量的上下兩相溶液于TLC板上。通過觀察斑點色度，比較分配系數(shù)的差異，選擇合適的溶劑系統(tǒng)。展開劑為氯仿－甲醇 －水（65∶35∶10，體積比，下層），顯色劑為10%硫酸甲醇溶液。

1.3.4 溶劑系統(tǒng)的準備

本試驗所用溶劑系統(tǒng)為氯仿－石油醚－甲醇－水（5∶2∶6∶4，體積比），將 4種溶劑按比例配置于分液漏斗中，充分振蕩后靜置分層。

1.3.5 HSCCC分離過程

在60 mL流動相中加入3 g樣品，充分振蕩，使樣品完全溶解，注入三通進樣閥。將固定相以一定的流速充滿色譜柱，然后將柱的首段與三通進樣閥相接。開啟速度控制器，當轉(zhuǎn)速達到800 r／min時，以2 mL／min的流速泵入流動相，并通過三通進樣閥進樣。當流動相從色譜柱流出時用部分收集器收集，并采用TLC點樣檢測分離情況。

1.3.6 分析型高效液相－蒸發(fā)光散射（HPLCELSD）分析

色譜柱：Waters Symmetry Cl8（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水（60∶40）；流速：1.0 mL／min；柱溫：25℃；SEDEX75蒸發(fā)光檢測器參數(shù)：載氣為空氣，漂移管溫度70℃，ELSD的增益值為7，壓力0.35 MPa。

1.3.7 制備型高效液相（Pre－HPLC）分析

制備柱：ODS－BP－30（250 mm×30 mm，15μm）；流動相：乙腈：水（55：45）；流速：10.0 mL／min；柱溫：25℃；進樣量：3.0 mL；樣品濃度：300 mg／mL。

1.3.8 體外腫瘤細胞增殖抑制試驗［15］

采用MTT法檢測藥物對細胞的抑制作用。取人結(jié)腸癌COLO205細胞和小鼠黑色素瘤B16－F10對數(shù)生長期腫瘤細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔100μL細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，接種24 h后給藥（100μL／孔），分別設(shè)空白對照組和不同濃度藥物組（62，125，250，500μg／mL），每組設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后每孔加入 100μL MTT（1 mg／mL，以DMEM培養(yǎng)液溶解），37℃培養(yǎng)2 h，棄去各孔內(nèi)液體后加入150μL酸化異丙醇（含 0.04 mol／L HCl），避光放置30 min，DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀測定570 nm處吸光度，計算抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0軟件將抑制率數(shù)據(jù)和甘油糖脂處理濃度進行l(wèi)ogistic曲線擬合并進行probit轉(zhuǎn)化，計算IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSCCC分離溶劑體系選擇

為了檢查溶劑系統(tǒng)的適用性，需要對分配系數(shù)進行測定。本試驗采用薄層色譜法（TLC）進行溶劑系統(tǒng)的選擇，即根據(jù)斑點色度估計樣品組分在兩相溶劑中的分配情況。雖然TLC法的準確度較低，但方便、快速。按照溶劑系統(tǒng)選擇的原則和大量的篩選，得到以下3種溶劑系統(tǒng)。

圖1 糖脂在3種溶劑系統(tǒng)中上下相的薄層色譜圖

由圖1可知，甘油糖脂粗提取物（Fr60）中至少有3種甘油糖脂單體 GCL－I、GCL－II和 GCL－III，即Rf＝0.19，Rf＝0.33，Rf＝0.55。由于不同的甘油糖脂單體所含糖基個數(shù)不同，極性差異較大，因此在溶劑系統(tǒng) A中，GCL－I和 GCL－II主要集中在下相，而GCL－III主要集中在上相，分配系數(shù)很不理想。為了使甘油糖脂組分GCLI和GCL－II在溶劑系統(tǒng)上相中有合適的分配，需在溶劑體系A(chǔ)的基礎(chǔ)上加入一定量的石油醚溶劑，由于石油醚主要進入下相，使得下相極性變?nèi)酰仁挂徊糠指视吞侵M分向上相轉(zhuǎn)移，從而得到合適的分配系數(shù)。最后，選定系統(tǒng)C作為高速逆流色譜分離的溶劑體系，即氯仿－石油醚－甲醇 －水（5∶2∶6∶4）。

2.2 HSCCC洗脫模式的選擇

由于HSCCC允許粗樣直接上樣分離，有時樣品非常復(fù)雜，其組分所覆蓋的極性范圍很寬（如甘油糖脂組分 GCL－I、GCL－II和 GCL－III），采用梯度或等比例洗脫很難實現(xiàn)一次性分離，因此本試驗采用雙向洗脫模式（dual－mode elution），即第一步采取反向洗脫（上相為固定相，下相為流動相），第二步采取正向洗脫（上相為流動相，下相為固動相）［16］。

2.3 溶劑系統(tǒng)C HSCCC－D1200分離結(jié)果

第一步采取反相洗脫，以上相為固定相，下相為流動相。試驗條件：氯仿－石油醚－甲醇－水（5∶2∶6∶4），進樣量 3.0 g，流動相流速為 2.0 mL／min，轉(zhuǎn)速800 r／min，收集 6 min／tube（15 mL試管），固定相保留率62%。根據(jù)TLC結(jié)果（圖2）可知，通過第一步反向洗脫后，可將甘油糖脂組分GCL－I和GCL－II完全分離開來。合并30～72管和84－134管，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥后分別得GCL－I（300 mg）和GCL－II（600 mg）。

圖2 HSCCC－D1200分離南瓜甘油糖脂的薄層色譜圖

第二步采取正向洗脫，即當GCL－I和GCL－II被分離后，將原來的固定相換作流動相，從相反的方向泵入柱中。根據(jù)TLC結(jié)果（圖3）可知，通過第二步正向洗脫后，可將甘油糖脂組分GCL－III分離開來。合并10～56管，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和冷凍干燥后得GCL－III（300 mg）。

圖3 HSCCC－D1200分離南瓜甘油糖脂的薄層色譜圖

2.4 HPLC制備分離

經(jīng)高效液相－蒸發(fā)光散射（HPLC－ELSD）檢測發(fā)現(xiàn)，3種甘油糖脂組分 GCL－I、GCL－II和GCL－III并不是單體，它們都分別含有2種化合物，說明這2種化合物結(jié)構(gòu)極其相似，采用HSCCC很難一步將其分離，還需進一步聯(lián)合制備型HPLC分離。

圖4為組分 GCL－I、GCL－II、GCL－III的制備型HPLC分離圖譜。收集主峰，減壓濃縮至干，最后冷凍干燥，分別得到化合物 1（105 mg）、2（145 mg）、3（250 mg）、4（245 mg）、5（105 mg）和6（120 mg），經(jīng)HPLC－ELSD測定，純度均達到98%以上。

圖4 GCL－I，GCL－II和GCL－III的制備型HPLC色譜圖

2.5 結(jié)構(gòu)鑒定

應(yīng)用多種波譜學(xué)方法（1H NMR，13C NMR，DEPT 90／135，HSQC，HMBC，HR－ESI－MS等），參照文獻［17］，確定6個單體化合物分別為二半乳糖亞麻酰甘油（DGMG，18∶3）、二半乳糖亞油酰甘油（DGMG，18∶2）、三半乳糖亞麻酰甘油（TGMG，18∶3）、三半乳糖亞油酰甘油（TGMG，18∶2），四半乳糖亞麻酰甘油（QGMG，18∶3）和 四半乳糖亞油酰甘油（QGMG，18∶2），如圖5。

圖5 甘油糖脂的結(jié)構(gòu)式

2.6 甘油糖脂的抗腫瘤活性

表1 甘油糖脂對人結(jié)腸癌細胞COLO205和小鼠黑色素瘤細胞B16－F10體外增殖抑制效果（IC50）

由表1可以看出，6種甘油糖脂對人結(jié)腸癌細胞COLO205和小鼠黑色素瘤細胞B16－F103均有一定的生長抑制作用。構(gòu)效關(guān)系表明，雙糖三鍵甘油糖脂DGMG（18∶3）對人結(jié)腸癌 COLO205細胞和小鼠黑色素瘤B16－F10細胞的抗腫瘤活性最強（P＜0.01），其半數(shù)抑制濃度 IC50分別為0.052 mg／mL和0.046 mg／mL，TGMG（18∶3）次之，而四糖雙鍵甘油糖脂QGMG（18∶2）抗腫瘤活性最弱，說明甘油糖脂結(jié)構(gòu)組成對其活性有很大的影響，即脂酰基飽和度的不同、糖基數(shù)目的不同都會影響到甘油糖脂的抗腫瘤活性。表1數(shù)據(jù)顯示，甘油糖脂抗腫瘤活性隨著分子中半乳糖基數(shù)目的增多，活性減弱，雙糖活性最強，四糖活性較弱；分子中糖基數(shù)目一定，抗腫瘤活性隨著不飽和程度的增加而提高，如含3個不飽和鍵的甘油糖脂 DGMG（18∶3）和 TGMG（18∶3）抗腫瘤活性分別強于含2個不飽和鍵的甘油糖脂DGMG（18∶2）和TGMG（18∶2），這一研究結(jié)果與Hou CC等的研究結(jié)果相一致。Hou CC等［12］從昭和草中分離得到一種含雙亞麻?；母视吞侵琩LGG，結(jié)構(gòu)－活性相關(guān)性研究證明雙亞麻?；视徒Y(jié)構(gòu)部分為重要的活性結(jié)構(gòu)特征，富含dLGG成分的昭和草萃取物較癌癥化療藥劑——順鉑更顯著抑制小鼠皮膚黑色素腫瘤的生長。

3 結(jié)論

本研究采用高速逆流色譜與制備型高效液相相結(jié)合的方法，從南瓜中制備出6種高純度的甘油糖脂單體，該方法制備量大（達到克量級），分離效率高，節(jié)約成本（溶劑系統(tǒng)可反復(fù)使用），是一種極具潛力的制備方法?？鼓[瘤作用的試驗研究表明，6種甘油糖脂單體對人結(jié)腸癌細胞COLO205和小鼠黑色素瘤細胞B16－F103均有一定的生長抑制作用，其中雙糖三鍵甘油糖脂 DGMG（18∶3）對人結(jié)腸癌 COLO205細胞和小鼠黑色素瘤B16－F10細胞的抗腫瘤活性最強，其半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.052 mg／mL和0.046 mg／mL，TGMG（18∶3）次之，而四糖雙鍵甘油糖脂QGMG（18∶2）抗腫瘤活性最弱。構(gòu)效關(guān)系表明，抗腫瘤能力隨著脂?；伙柡统潭鹊脑黾佣岣?，隨糖基數(shù)目的增加而降低。南瓜中糖苷類化合物作為抗腫瘤藥物具有較好的開發(fā)前景。需要說明的是，盡管提取過程中使用了大量的對人體有害物質(zhì)，但將提取物中的有毒的有機溶劑蒸干后，再加入無毒的有機溶劑，比如乙醇，再將乙醇蒸干后，基本上就檢不出有毒的有機溶劑殘留了，因而不會影響該化合物在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

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