內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白在壓瘡局部缺血性損傷中的表達*

崔飛飛，潘瑩瑩，張 龍，謝浩煌，時洪雪，肖 健，姜麗萍

（溫州醫(yī)學院護理學院，浙江溫州325035）

壓瘡是臨床常見的并發(fā)癥，是皮膚或皮下組織由于壓力，或復合有剪切力或／和摩擦力作用發(fā)生在骨隆突處的局限性損傷［1］。局部組織缺血、缺氧，可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），過強或持續(xù)的ERS導致細胞凋亡。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）、同源蛋白（homology protein，CHOP）是ERS的特異性蛋白，其可以反映ERS的程度，心、腦等缺血性損傷中已經(jīng)對ERS相關蛋白介導的細胞損傷有所報道［2］，但在壓瘡損傷過程中的作用鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性SD大鼠40只（上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供），體重320～350 g。大鼠自由飲水、進食，室溫（25±2）℃，分籠喂養(yǎng)。GRP78、CHOP抗體均由 Santa Cruz Biotechnology提供，二抗和內(nèi)參抗體分別由上海碧云天生物技術研究所和武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及分組 參照王艷艷等［3］的方法制備早期壓瘡動物模型。40只SD大鼠自由飲水，腹腔注射麻醉后，將大鼠俯臥于泡沫床墊上，暴露施壓部位。隨機分為對照組、實驗組分為1個周期組（1 c組）、3個周期組（3 c組）、6個周期組（6 c組）、9個周期組（9 c組）（n＝8），各組體重比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。1 c組：對兩側(cè)大腿股薄肌施加22.47 kPa壓強，持續(xù)施壓 2 h，放松 0.5 h，即 1個周期；3 c組、6 c組、9 c組：于同一部位施加等同大小的壓強，同樣周期分別重復3次、6次、9次（一天進行3個周期）；對照組：未施壓力。各組大鼠于實驗終點給予安樂死。

1.2.2 標本制備 實驗終點，迅速取受壓中心部位肌肉組織（約500mg），存于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，用于HE染色、免疫組化和Western blot檢測。

1.2.3 組織形態(tài)學觀察 組織常規(guī)脫蠟、梯度透明、蘇木精-伊紅染色，用 Nikon（TE2000-U）顯微鏡觀察，NISElements圖像采集軟件采集圖像，觀察壓瘡局部肌肉組織病理學變化。

1.2.4 免疫組織化學法 采用 SABC法，常規(guī)設立陰性對照。3%H2O2處理后熱修復抗原，5%BSA封閉，一抗 （1∶100）4℃過夜，生物素化二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，鏡下進行定性觀察。

1.2.5 Western blot 取組織各200 mg，加入組織蛋白裂解液，勻漿后，離心取上清，按 Bradford法測量蛋白濃度。配制SDS聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗孵育，4℃過夜。TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記二抗，孵育1 h，TBST洗滌。ECL顯色、曝光，常規(guī)方法顯影、定影。以GAPDH作為內(nèi)參，用Image J軟件分析系統(tǒng)分析，GRP78、CHOP蛋白含量分別用GRP78／GAPDH、CHOP／GAPDH表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，使用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，組間差異采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。

2 結(jié)果

2.1 受壓肌肉組織的病理改變

光鏡下觀察顯示：對照組肌纖維排列緊密，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，骨骼肌橫紋清晰，無明顯的炎性細胞浸潤；實驗組，受壓肌肉組織逐步出現(xiàn)退化的病理變化，表現(xiàn)為肌纖維排列紊亂、水腫，肌間隙增寬，間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)炎癥細胞浸潤，肌纖維出現(xiàn)溶解、斷裂、壞死碎片、空泡變性、玻璃樣變性等病理改變（圖 1）。

2.2 各組受壓肌肉組織中GRP78、CHOP蛋白表達

2.2.1 GRP78蛋白表達情況 免疫組化結(jié)果顯示：GRP78免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，主要位于胞漿，細胞形態(tài)相對飽滿。GRP78蛋白在對照組中呈低表達，在1 c組表達不明顯，3 c組表達顯著，隨后6 c、9 c組下降（圖2）。

2.2.2 CHOP蛋白表達情況 免疫組化結(jié)果顯示：其棕黃色顆粒，在胞漿和細胞核表達，多數(shù)陽性細胞形態(tài)已經(jīng)發(fā)生改變，胞核呈固縮狀。CHOP蛋白在對照組中呈低表達，在1 c組表達升高，3 c組、6 c組下降，9 c組再次升高（圖3）。

Fig.2 Expression of GRP78 protein in compressed muscles tissue（IHC×200）

2.3 Western blot檢測GRP78、CHOP蛋白在受壓組織中的表達

Western blot結(jié)果表明：與對照組相比，GRP78蛋白1 c組開始表達，3 c組達到高峰（P＜0.05），6 c、9 c組表達下降（P＜0.05）；CHOP蛋白 1 c組升高顯著（P＜0.05），3 c組開始下降（P＜0.05），6 c組下降明顯（P＞0.05），9 c組再次升高（P＜0.05，表 1）。

Fig.3 Expression of CHOP protein in compressed muscles tissue（IHC×200）

Tab.1 Expression of GRP78，CHOP protein in compressed muscles tissue detected by Western blot（OD，±s，n＝3）

Tab.1 Expression of GRP78，CHOP protein in compressed muscles tissue detected by Western blot（OD，±s，n＝3）

GRP78：Glucose regulated protein 78；CHOP：Homology protein；C：Cycle*P＜0.05 vs control group

Group GRP78 protein CHOP protein Con 0.64±0.12 0.58±0.18 1c 1.20±0.34 1.48±0.27*3c 1.59±0.24* 1.03±0.21*6c 1.17±0.28* 0.95±0.30 9c 1.09±0.33* 1.69±0.34*

3 討論

前期研究表明，壓瘡損傷的形成并非急性高壓力所致的，而是由間歇性較低壓力重復作用所造成的局部組織的不完全性缺血再灌注損傷［4］。此過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）功能發(fā)生紊亂，激活ERS反應。GRP78是ERS的敏感標記物，CHOP是特異凋亡蛋白。GRP78具有細胞的保護作用，ERS持續(xù)存在或過強時，激活CHOP蛋白表達，誘導細胞凋亡［5］。但壓瘡局部組織損傷與ERS介導的細胞功能障礙之間的關系研究較少。

本實驗形態(tài)學結(jié)果表明，受壓局部肌肉組織出現(xiàn)逐步退化病理變化，即炎癥細胞增多、肌間隙增寬、肌纖維出現(xiàn)水腫、溶解、斷裂、空泡化、玻璃樣改變現(xiàn)象，這與臧爽等研究結(jié)果一致。這可認為，由于外部施加的壓力誘發(fā)了組織缺血缺氧，當恢復血流灌注時，導致大量的氧自由基生成，同時伴隨鈣離子超載，造成細胞損傷。

生理狀況下GRP78處于無活性狀態(tài)，當發(fā)生ERS時，可誘導GRP78表達，來結(jié)合未折疊蛋白，減少其在ER腔內(nèi)聚集，當ERS持續(xù)存在時，則激活下游的凋亡因子CHOP蛋白。本研究免疫組化和Western blot結(jié)果均顯示GRP78和CHOP蛋白表達總體呈上升趨勢，其早期表達可能與局部受壓肌組織持續(xù)受壓，導致受壓組織缺血缺氧，產(chǎn)生自由基級聯(lián)反應，使ER腔內(nèi)的蛋白氧化修飾有關；GRP78在3 c表達達高峰而CHOP表達下降，揭示了ER中未折疊或錯誤折疊蛋白大量積聚，觸發(fā)未折疊蛋白反應，加強ER對蛋白的折疊能力，來減輕ER的負荷壓力，減少細胞損傷；但隨著循環(huán)次數(shù)增加GRP78表達又下降而CHOP在9 c組表達卻再次升高，提示由于持續(xù)受壓和再灌注損傷的聯(lián)合作用，局部組織缺血缺氧加劇，ER折疊酶或分子伴侶功能異常，導致ERS持續(xù)存在或反應過度，使GRP78無法處理ER堆積的錯誤蛋白，且誘導CHOP的表達來處理過度受損的細胞，以此來恢復ER內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。李蕊君等報道GRP78在心肌細胞缺氧0.5 h即開始表達，缺氧1 h達到高峰，之后隨著缺氧時間的延長表達逐漸下降；左群等報道，CHOP的表達表現(xiàn)為運動后呈上升趨勢，1 d時出現(xiàn)第一次高峰，之后略有下降，1周達到高峰，2周時出現(xiàn)下降趨勢，本實驗結(jié)果趨勢與其一致。

綜上所述，ERS參與了壓瘡損傷過程，壓瘡損傷難以愈合的原因可能與ERS誘導的細胞損傷有關，但具體的細胞信號通路，需進一步研究。

【參考文獻】

［1］ Stekelenburg A，Gawlitta D，Bader D L，etal.Deep Tissue Injury：How Deep is Our Understanding［J］.ArchPhysMed Rehabil，2008，89（7）：1410-1413.

［2］ DeGracia D J，Montie H L.Cerebral ischemia and the unfolded protein reasonse［J］.JNeurochem，2004，91（1）：1-8.

［3］ 王艷艷，孫海琴，張純瑜，等.壓瘡早期動物模型制備及評價［J］.護理學雜志，2010，25（14）：1-5.

［4］ 蔡福滿，姜麗萍，楊曄琴，等.褥瘡不完全性缺血再灌注損傷簡易模型的建立［J］.中國病理生理雜志，2009，25（4）：830-832.

［5］ Oyadomari S，Mori M.Roles of CHOP／GADD153 in endoplasmic reticulum stress［J］.CellDeathDiffer，2004，11（4）：381-389.