單純皰疹病毒1型糖蛋白D主要抗原表位區(qū)的表達(dá)、純化及鑒定

劉 紅，劉 賓，和 驍，趙曉濤*

(北京大學(xué)1.人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100044;2.工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，北京100871)

單純皰疹病毒(herpes simplex virus type，HSV)屬于皰疹病毒科α-亞科，是雙鏈DNA 病毒。感染HSV 可導(dǎo)致皰疹性腦炎、生殖器皰疹和宮頸癌等多種疾病，是可導(dǎo)致胎兒先天性畸形和死亡的病原體之一［1］。目前，病毒培養(yǎng)被認(rèn)為是HSV 原發(fā)性感染早期診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［2］。但是，在感染的恢復(fù)期和復(fù)發(fā)性感染期病毒培養(yǎng)檢測(cè)的陽性率較低，且容易受到樣本采集和運(yùn)輸過程等影響培養(yǎng)結(jié)果。而免疫學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于診斷HSV 感染的臨床檢測(cè)。

根據(jù)血清型的不同，HSV 可以分為HSV-1 型和HSV-2 型［3］，HSV-1 屬于傳播最廣泛的皰疹病毒之一［4］，具有一次感染終身潛伏、周期循環(huán)發(fā)病的特性［5］。其基因組全長(zhǎng)約152 kb，編碼超過80 種不同的開放閱讀框(ORFs)，包括約16 種糖蛋白和一些其他膜結(jié)合蛋白［6］。HSV-1 糖蛋白(glycoprotein D，gD)全長(zhǎng)395 個(gè)氨基酸，在HSV-1 進(jìn)入宿主細(xì)胞過程中起重要作用，是構(gòu)成HSV-1 的蛋白中免疫原性最強(qiáng)的糖蛋白［7］。HSV-1 和HSV-2 gD 氨基酸序列高度保守，具有共同的抗原表位，在體內(nèi)可引起高滴度的HSV 中和抗體，是HSV 檢測(cè)通用的共同抗原［8］。本研究旨在通過抗原表位預(yù)測(cè)和原核表達(dá)技術(shù)，將HSV-1 gD MED 在體外進(jìn)行表達(dá)和純化，為HSV 免疫檢測(cè)方法建立和基因工程疫苗的研制奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清:為經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)后，確認(rèn)為人HSV-1 抗體陽性的外周血血清標(biāo)本，分離血清后－80 ℃保存。

1.1.2 質(zhì)粒和菌株:pET-GST 質(zhì)粒(深圳勤寶升生物技術(shù)開發(fā)公司);E．coli TOP10 和BL21(DE3)pLysS 菌株(均本實(shí)驗(yàn)室保存菌株)。

1.1.3 主要試劑:限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、T4 連接酶和IPTG(大連寶生物工程公司);DNA Marker、蛋白質(zhì)預(yù)染Marker、普通DNA 聚合酶和Pfu聚合酶(北京全式金生物技術(shù)公司);質(zhì)粒提取試劑盒(Omega Bio-tek 公司);GST·Bind 純化試劑盒購(Merck 公司);普通DNA 產(chǎn)物回收試劑盒、普通蛋白質(zhì)Marker、BCIP/NBT 底物顯色試劑盒和Bradford蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司);丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺(Genview 公司);3000 u透析袋、SDS、Tris 堿(北京華美生物工程公司);堿性磷酸酶標(biāo)記山兔抗人免疫球蛋白IgM 抗體(Sigma 公司);其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 HSV-1 gD 抗原表位預(yù)測(cè):應(yīng)用Lasergen 7.0中Protean 軟件的Garnier-Robson 和Chou-Roboson的二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary probability)預(yù)測(cè)模塊、Hopp-Woods 和Kyte-Doolittle 的親水性(hydrophilicity)預(yù)測(cè)模塊、JamesoNwolf 的抗原性(antigenicity)預(yù)測(cè)模塊、Karplus-Schulz 的可塑性(flexibility)預(yù)測(cè)模塊、Emini 的表面可及性(surface probility)預(yù)測(cè)模塊［9］，對(duì)從NCBI 上得到的HSV-1 gD 氨基酸序列(Gen-Bank:JQ320083.1)的抗原表位預(yù)測(cè)，確定HSV-1 gD MED。

1.2.2 HSV-1 gD MED 編碼基因的合成:根據(jù)HSV-1 gD cDNA 序列(GenBank:JQ320083.1)，針對(duì)原核表達(dá)宿主，對(duì)預(yù)測(cè)的HSV-1 gD MED cDNA 序列進(jìn)行偏愛密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)后，由上海生工生物工程公司合成，并插入到pUC57 載體上，插入位點(diǎn)為EcoR Ⅴ。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建:利用Primer 5.0 軟件，根據(jù)合成的HSV-1 gD MED 序列設(shè)計(jì)引物:上游引物MED-F 5'-CGCGGATCCTGGCACGGGCCCAAG GC-3'，引入BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)(以下劃線標(biāo)出)和保護(hù)堿基;下游引物MED-R 5'-CCCAAGCTTTTAGTA AAACAAGGGCTGGTG-3'，引入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)(以下劃線標(biāo)出)、終止密碼子TTA 和保護(hù)堿基，由上海生工生物工程公司合成。用Pfu 聚合酶PCR 擴(kuò)增gD MED 基因，反應(yīng)體系如下:MED-F 和MED-R 各2 μL(引物濃度為10 μmol/L)，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，pUC57-gD MED 質(zhì)粒1 μL，Pfu 酶(2.5 U/μL)1 μL，10 ×EasyPfu 緩沖液5 μL，去離子無菌水補(bǔ)足至50 μL;PCR 程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

按照產(chǎn)品說明書，將PCR 產(chǎn)物回收后，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并命名為pET-GST-gD MED，并將其轉(zhuǎn)化E．coli BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

1.2.4 gD MED 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):挑取陽性pET-GST-gD MED/E．coli BL21(DE3)pLysS 單菌落接種到5 mL 含Amp 的液體LB 培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜;將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100的比例轉(zhuǎn)接到100 mL含Amp 的液體TB 培養(yǎng)基中，37 ℃250 r/min 振蕩培養(yǎng);當(dāng)菌液A595達(dá)到0.5 ～0.8 時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，28 ℃250 r/min振蕩培養(yǎng)4 h;吸取1 mL菌液4 ℃保存，將剩余誘導(dǎo)菌液分成等體積兩份，離心收集菌體，PBS(pH 7.0)洗滌菌體后分別用10 mL PBS 和10 mL含8 mol/L尿素的PBS 重懸菌體;超聲裂解菌體;離心后收集上清，進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。

1.2.5 gD MED 重組蛋白的純化:將1 L大量誘導(dǎo)后的菌液收集菌體，根據(jù)重組蛋白的表達(dá)形式和GST·Bind 純化試劑盒操作手冊(cè)對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化;12%分離膠和5%濃縮膠對(duì)溶蛋白洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè);收集只含有目的蛋白的洗脫液，4 ℃透析過夜;將透析袋內(nèi)溶液凍干，－20 ℃保存;SDS-PAGE 檢測(cè)gD MED 融合蛋白的純度。

1.2.6 gD MED 融合蛋白的Western blot 檢測(cè):用半干轉(zhuǎn)膜儀12 V電轉(zhuǎn)40 min，將SDS-PAGE 后的分離膠轉(zhuǎn)印到0.45 μm PVDF 膜上;將PVDF 膜用含3% BSA 的TBS-T 在4 ℃封閉過夜;室溫下用TBS-T洗膜4 次，每次10 min;用含1%小牛血清白蛋白的TBS-T 將人HSV-1 陽性血清稀釋500 倍作為一抗，室溫下與PVDF 膜雜交2 h;重復(fù)洗膜步驟;用含1%BSA 的TBS-T 將堿性磷酸酶標(biāo)記的山兔抗人免疫球蛋白IgM 抗體稀釋10 000倍作為二抗，室溫下與PVDF 膜雜交2 h;重復(fù)洗膜步驟;用BCIP/NBT 顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 HSV-1 gD 抗原位表位分析

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示HSV-1 gD 共含有10 個(gè)α-螺旋區(qū)域，24 個(gè)β-折疊區(qū)，N 端分布密度大于C 端，而轉(zhuǎn)角區(qū)有27 個(gè)，無規(guī)則卷曲13 個(gè)，C 端分布密度大于N 端，表明該蛋白的后半段柔性較高，發(fā)生折疊的概率較高;親水性預(yù)測(cè)顯示，gD 具有形成20 個(gè)親水區(qū)潛能，分布較均勻;表面可及性區(qū)18 個(gè)，分布趨勢(shì)與親水區(qū)相似;可塑性區(qū)有22 個(gè)，C 端密度高于N端;抗原指數(shù)分析顯示，該蛋白大部分序列抗原指數(shù)都大于0，主要有20 個(gè)區(qū)域。綜合以上預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)合蛋白抗原表位一般至少有8 個(gè)氨基酸構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)［10］，從gD 上篩選出38 ～47、68 ～77、144 ～160、266～274、279 ～290、294 ～301、302 ～309、326 ～339 和364 ～373 共9 個(gè)潛在抗原表位，其中6 個(gè)表位都分布在第266 位氨基酸后面，并且比較密集，為了獲得免疫原性較好的HSV-1 gD 抗原，本研究選擇266 ～394位氨基酸序列作為HSV-1 gD MED(圖1)。

2.2 gD MED 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以密碼子優(yōu)化后的HSV-1 gD MED cDNA 序列為模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增gD MED cDNA 序列，電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物可見1 條約400 bp的目的片段，與預(yù)期大小一致。菌落PCR 驗(yàn)證pETGST-gD MED/E．coli(TOP10)，電泳檢測(cè)表明產(chǎn)物與目的片段預(yù)測(cè)大小一致。

提取pET-GST-gD MED/E．coli(TOP10)陽性克隆的質(zhì)粒，以MED-F 和MED-R 引物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序結(jié)果與HSV-1 gD cDNA 序列(GenBank:JQ320083.1)比對(duì)，結(jié)果表明插入序列與HSV-1 gD cDNA 編碼gD MED 區(qū)域(796 ～1 182)的序列完全相同。將測(cè)序正確的pET-GST-gD MED 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E．coliBL21(DE3)pLysS，提取陽性菌落質(zhì)粒用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切驗(yàn)證，得到目的片段大小約為400 bp(圖2)，表明pET-GST-gD MED 載體構(gòu)建正確。

2.3 gD 融合蛋白的表達(dá)

經(jīng)1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)4 h后，在分泌蛋白和包涵體組分中都有一條分子質(zhì)量約為45 ku的特異條帶產(chǎn)生，符合理論分子質(zhì)量大小，推測(cè)為目的蛋白，且可溶分泌性表達(dá)量高于包涵體形式表達(dá)量(圖3)。

2.4 gD MED 融合蛋白的純化

將大量誘導(dǎo)的pET-GST-gD MED/E．coliBL21(DE3)pLysS 菌液中菌體收集后，對(duì)其分泌蛋白組分進(jìn)行純化、透析和凍干處理后，得到了純度能達(dá)到95%的gD MED 融合蛋白(圖4)。

2.5 gD MED 融合蛋白免疫活性分析

純化的HSV-1 gD MED 融合蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，能與人HSV-1 陽性血清產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)，產(chǎn)生清晰的蛋白印跡(圖5)，表明純化產(chǎn)物具有免疫活性，具有抗原活性。

3 討論

HSV-1 感染大多發(fā)生在兒童期，主要引起口腔皰疹(唇皰疹)、眼部皰疹，或者引起危及生命的腦炎［1］。HSV-2 是引起反復(fù)發(fā)生生殖器皰疹的致病因子，通過性途徑傳播［2］，并且會(huì)增加HIV 感染的危險(xiǎn)，如果感染發(fā)生在妊娠期，還會(huì)引起流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎。我國(guó)人群具有HSV 較高的感染率，很多地區(qū)HSV-1 或HSV-2 抗體(IgG)攜帶者達(dá)40% ～95%，而且約60%的兒童在5 歲前就已被HSV 感染，但其中絕大多數(shù)為HSV 終身攜帶者，并無相應(yīng)病癥出現(xiàn)，雖然其中只有1% ～15%的受感者會(huì)產(chǎn)生病癥，但其中約50%的患者每年都會(huì)發(fā)病1 次［11］。因此，明確HSV 感染的診斷以及類型確定在患者管理、預(yù)后和傳染控制等方面就具有重要意義。

糖蛋白D 是HSV 中抗原性最強(qiáng)的蛋白，而且HSV-1 gD 與HSV-2 的gD 之間具有很高的同源性，一直被作為HSV 共同抗原應(yīng)用在其免疫診斷試劑上?？贵w對(duì)抗原的識(shí)別，不是對(duì)抗原整個(gè)分子的識(shí)別，而是通過對(duì)抗原上的抗原表位進(jìn)行識(shí)別，達(dá)到對(duì)抗原的特異識(shí)別［12］。通過對(duì)HSV-1 gD 和HSV-2 gD 的單抗與其gD 的結(jié)合特性研究發(fā)現(xiàn)，HSV-1 和HSV-2 gD 具有相同的抗原表位，并且這些表位有一些位于gD 的N 端區(qū)域［13］。根據(jù)HSV-1 gD 氨基酸序列合成的小肽中有12 條(10 ～24、151 ～165、216～232、244 ～267、260 ～274、270 ～284、260 ～284、282 ～301、300 ～314、340 ～354、348 ～362 和355 ～369)對(duì)小鼠超免血清有反應(yīng)［14］。隨著生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，抗原表位預(yù)測(cè)技術(shù)也取得了很大的發(fā)展，大大降低了表位確認(rèn)的成本和時(shí)間［9］?？乖砦活A(yù)測(cè)參數(shù)中，親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、可及性有較好的效果，是最重要的3 項(xiàng)預(yù)測(cè)參數(shù)，但準(zhǔn)確預(yù)測(cè)還須考慮氨基酸所處序列的抗原性、可塑性等參數(shù)［15］。本研究中，通過對(duì)HSV-1 gD 的親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、可及性、抗原性和可塑性等的綜合預(yù)測(cè)分析，從gD 上篩選出38 ～47、68 ～77、144 ～160、266～274、279 ～290、294 ～301、302 ～309、326 ～339 和364 ～373 共9 個(gè)潛在抗原表位，其中6 個(gè)表位都分布在第266 位氨基酸后面，與Bosch 和Geerligs 等的研究結(jié)果基本相符合。

圖5 gD MED 融合蛋白免疫活性檢測(cè)Fig 5 Immunological activity detection of recombinant gD MED protein

目前診斷HSV 感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段主要有:1)傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng):因耗時(shí)長(zhǎng)，無法為臨床提供及時(shí)的結(jié)果，因而很少應(yīng)用;2)核酸檢測(cè)方法:雖然快速敏感，但只有在疾病急性期、現(xiàn)癥感染時(shí)才有可能檢出;3)免疫學(xué)檢測(cè)方法:由于具有靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，既能反應(yīng)近期感染也能進(jìn)行既往感染的檢測(cè)，因而被廣泛應(yīng)用于HSV 感染診斷上。但目前國(guó)內(nèi)HSV 診斷試劑盒多以進(jìn)口gD 作為抗原包被，或者利用全病毒作為抗原，成本較高，或靈敏度和特異性較差。本研究利用原核表達(dá)和GST純化，根據(jù)表位預(yù)測(cè)結(jié)果，利用E．coli 和pET-GST表達(dá)載體，成功表達(dá)和純化了HSV-1 gD MED，獲得了純度達(dá)到95%的gD MED 融合蛋白，并且具有很好的免疫原性，為HSV 感染診斷的進(jìn)一步研究、免疫診斷試劑研發(fā)以及基因工程疫苗的研發(fā)奠定了良好的工作基礎(chǔ)，在臨床實(shí)驗(yàn)室研究方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

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