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    α-突觸核蛋白與Nurr1相互作用增強(qiáng)致小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系腫瘤壞死因子α表達(dá)增多

    2013-12-07 08:04:54魯玲玲趙春禮段春禮
    關(guān)鍵詞:性反應(yīng)膠質(zhì)孵育

    莊 穎,魯玲玲,趙春禮,段春禮,楊 慧

    (首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系北京腦重大疾病研究院北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100069)

    帕金森病(Parkinson's Disease,PD)其主要病理特征為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)以聚集化的 α-突觸核蛋白(α-syuclein,α-syn)為主要成分的路易小體[1],并伴隨以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為主要特征的免疫炎性反應(yīng)[2-4],但此類炎性反應(yīng)的具體機(jī)制目前還不清楚。

    α-syn 是第一個被發(fā)現(xiàn)的 PD 致病基因[5-6]。在小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞中過表達(dá)野生型α-syn可致炎癥因子 TNF-α,NO 等釋放量顯著增高[7-8],但其確切分子機(jī)制目前尚無報道。

    Nurr1作為核受體超家族的一種轉(zhuǎn)錄因子與PD密切相關(guān)[10]。近年來,Saijo等發(fā)現(xiàn)用LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子后致Nurr1上調(diào),其入核后作為轉(zhuǎn)錄抑制子使炎性因子無法轉(zhuǎn)錄,當(dāng)敲減掉Nurr1后可促進(jìn)炎性反應(yīng)的發(fā)生[9]。

    因此,本研究觀察α-syn是否通過Nurr1調(diào)節(jié)炎性因子TNF-α產(chǎn)生,為闡明PD可能發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供線索。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    細(xì)胞:人源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SK-N-SH),(ATCC公司);小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系(BV2),由首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系王曉民教授惠贈;Wizard Plus Midipreps DNA Purification systems(Promega公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(Gibco公司);RIPA裂解液(北京普利萊基因有限公司);蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(Merck公司);Elisa試劑盒(R&D公司);胞質(zhì)胞核分離提取試劑盒(Millipore公司);anti-MYC 抗體、anti-β-actin(Sigma-aldrich公司);Histon抗體(CST公司);α-syn抗體(BD公司);Nurr1抗體(Santa公司);OX-6抗體(Abcam公司);人源α-syn慢病毒載體:LV-GFP-αsyn(上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司);人源α-syn質(zhì)粒(pCMV-MYC-α-syn)和人源Nurr1質(zhì)粒(pAAVNurr1)均由本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:SK-N-SH細(xì)胞,BV2細(xì)胞采用含10%的胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基,置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照lipofectamine2000操作說明書進(jìn)行。

    1.2.2 免疫組織化學(xué)染色:將攜帶有GFP標(biāo)簽的αsyn慢病毒感染的BV2細(xì)胞傳代于24孔板,棄掉培養(yǎng)基,PBS沖洗2次,加入4%多聚甲醛,室溫固定20 min,PBST室溫沖洗3次,8%山羊血清室溫孵育1 h,加入anti-myc(1∶1 000)、anti-OX-6(1∶1 000)和 anti-Nurr1(1∶100)一抗,4℃過夜,次日用PBST洗3次,加入相應(yīng)的熒光二抗(1∶500),37℃避光孵育1 h,PBST洗3次,加入DAPI于37℃避光孵育5 min復(fù)染細(xì)胞核,PBST沖洗3次,甘油封片后用激光共聚焦顯微鏡觀察。

    1.2.3 蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP):質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24 h收集SK-N-SH細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞裂解,留取少量作免疫印跡對照,其余上清用于免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。每個樣品加入10 μL相應(yīng)抗體(α-syn,Nurr1,IgG)及1 mL Co-IP緩沖液,加入IgG組作為空白對照,置于4℃旋轉(zhuǎn)孵育12 h后均加入Protein G agarose beads,于4℃輕輕旋轉(zhuǎn)12 h,洗滌緩沖液漂洗后加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液,95℃加熱5 min,然后離心取上清,進(jìn)行Western blot分析。

    1.2.4 蛋白印跡(Western blot):BCA法測蛋白濃度,SDSPAGE電泳,半濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,8% 脫脂牛奶封閉1 h,分別入 α-syn(1∶500)、Nurr1(1∶100)、β-actin(1∶1 000)一抗,4 ℃ 過夜。0.1%TBST洗膜3次,入相應(yīng)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔/鼠免疫球蛋白抗體中(1∶10 000),室溫孵育1 h,洗膜同前。加入化學(xué)發(fā)光液,于暗室化學(xué)發(fā)光及顯影、定影。

    1.2.5 胞質(zhì)胞核的分離提取:用α-syn慢病毒感染BV2細(xì)胞24 h,用胞質(zhì)胞核分離提取試劑盒進(jìn)行胞質(zhì)胞核蛋白分離提取(按照試劑盒說明書),進(jìn)行Western blot檢測。

    1.2.6 Elisa試劑盒檢測:轉(zhuǎn)染 Myc-vector,pCMVMYC-synuclein,pAAV-Nurr1質(zhì)粒于BV2細(xì)胞24 h后,分別取細(xì)胞上清,離心去除雜質(zhì),立即進(jìn)行檢測(按照試劑盒說明書),剩余樣品分裝后放于-20℃儲存。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

    2 結(jié)果

    2.1 α-syn和Nurr1存在亞細(xì)胞共定位

    α-syn與Nurr1在BV2細(xì)胞中存在共定位關(guān)系(圖1)。

    2.2 α-syn和Nurr1可能存在相互作用

    用Nurr1抗體可以免疫沉淀α-syn蛋白(圖2A)。用α-syn抗體可以免疫沉淀Nurr1蛋白(圖2B),而在上述實(shí)驗(yàn)的空載體對照組則沒有沉淀到相應(yīng)蛋白。

    2.3 過表達(dá)α-syn可抑制Nurr1核轉(zhuǎn)位

    用攜帶GFP標(biāo)簽的α-syn慢病毒成功感染B V2細(xì)胞后 (圖3A),可以觀察到BV2細(xì)胞激活即小膠質(zhì)細(xì)胞激活的特異性標(biāo)志OX-6產(chǎn)生增多,Nurr1的核轉(zhuǎn)位減少 (圖3B)。提取胞質(zhì)胞核蛋白進(jìn)行Western blot分析,在過表達(dá) α-syn組胞核中的Nurr1與正常組和對照組相比明顯減少 (圖3C)。

    圖3 過表達(dá)α-syn后對BV2中Nurr1核轉(zhuǎn)位的影響Fig 3 The influence ofα-syn overexpression on Nurr1 nuclear translocation in BV2 cells(×160)

    2.4 過表達(dá)α-syn和Nurr1明顯影響TNF-α的產(chǎn)生

    在BV2細(xì)胞中單獨(dú)過表達(dá)α-syn可使TNF-α產(chǎn)生顯著增多(p<0.05),而共表達(dá)α-syn與Nurr1可顯著減少TNF-α的產(chǎn)生 (p<0.05)(圖4)。

    圖4 過表達(dá)α-syn和Nurr1后對于BV2細(xì)胞TNF-α釋放的影響Fig 4 The influence ofα-syn-,Nurr1-or doubleoverexpression on TNF-αrelease in BV2 cells

    3 討論

    α-syn使得小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活產(chǎn)生炎性因子致多巴胺能神經(jīng)元的損傷可能在PD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。但α-syn是如何使小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),目前尚不明確。本研究利用BV2細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)α-syn和Nurr1存在共定位,說明二者具有發(fā)生相互作用的生物學(xué)基礎(chǔ)。同時蛋白質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示α-syn和Nurr1存在于一個蛋白質(zhì)復(fù)合體中,推測α-syn可能是通過與Nurr1發(fā)生相互作用,從而影響了Nurr1對于TNF-α產(chǎn)生的抑制。

    在以前的研究中Fan等人發(fā)現(xiàn)在原代小膠質(zhì)細(xì)胞中在LPS的刺激下,Nurr1會從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞核[5],而本實(shí)驗(yàn)中在過表達(dá)α-syn的 BV2細(xì)胞中Nurr1的核轉(zhuǎn)位減少,這說明LPS與α-syn導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞激活機(jī)制有可能是不同的。LPS作為一種外來抗原可以引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫炎性反應(yīng),從而導(dǎo)致Nurr1入核增多來抑制炎性因子產(chǎn)生,所以LPS導(dǎo)致的炎性反應(yīng)雖然快速劇烈但可逐步緩解。而α-syn導(dǎo)致的免疫炎性反應(yīng)雖然較LPS緩和卻是進(jìn)行性加重的,這可能是因?yàn)棣?syn與Nurr1發(fā)生了相互作用從而使得Nurr1入核減少,使Nurr1對于炎性因子的轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱,導(dǎo)致炎性反應(yīng)逐步加劇,但其具體的機(jī)制還要在以后的研究中進(jìn)一步探討。

    本研究通過Elisa發(fā)現(xiàn)單獨(dú)過表達(dá)α-syn可以使小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子TNF-α產(chǎn)生增加,當(dāng)同時過表達(dá)α-syn和Nurr1后TNF-α的產(chǎn)生有明顯減少,說明Nurr1在一定程度上參與了α-syn所致炎性因子的產(chǎn)生。之前有報道發(fā)現(xiàn)在敲減Nurr1的BV2細(xì)胞中,加入LPS刺激后其炎癥程度與正常BV2細(xì)胞相比明顯增強(qiáng)[9],本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Nurr1后α-syn導(dǎo)致的炎性反應(yīng)有所減輕,二者結(jié)果相一致。那么α-syn可能是通過與Nurr1發(fā)生相互作用,從而改變了Nurr1的活性,使其入核減少,繼而導(dǎo)致了TNF-α的轉(zhuǎn)錄無法得到抑制,使得炎性反應(yīng)加劇。本研究通過證明α-syn和Nurr1之間的相互作用為我們理解α-syn引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其引發(fā)的免疫炎性反應(yīng)在PD發(fā)病中的作用提供了一定的線索,但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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