大孔吸附樹(shù)脂純化黃芩中三種黃酮的含量測(cè)定

于艷，徐晶，修麗麗，田原

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032)

大孔吸附樹(shù)脂純化黃芩中三種黃酮的含量測(cè)定

于艷1，徐晶2*，修麗麗2，田原1

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032)

目的 建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大孔吸附樹(shù)脂富集純化后的黃芩提取物中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量的方法。方法 以AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黃芩水提取物中總黃酮進(jìn)行富集純化，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定其中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量。色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃。結(jié)果 黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素分別在0.022 4～0.448 0 μg (r=0.999 9)，0.021 0～0.420 0 μg(r=0.999 9)，0.010 3～0.205 0 μg(r=0.999 9)內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好；平均回收率分別為97.3%(RSD 1.71%)，98.4%(RSD 2.05%)，98.1%(RSD 1.65%)。黃芩水提取物經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純化后，黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的平均含量分別為27.52%、6.87%和2.13%，未經(jīng)純化的黃芩水提取物中三者的平均含量分別為9.16%、1.66%和0.54%。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，重復(fù)性好。

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，為臨床常用中藥，其性味苦、寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎之功效，用于濕溫、暑濕、胸悶嘔惡、濕熱痞滿(mǎn)、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽、高熱煩渴、血熱吐衄、癰腫瘡毒、胎動(dòng)不安[1]。黃芩有效成分黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化、抗炎、抗變態(tài)、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等廣泛藥理作用[2-3]。

近年來(lái)，大孔吸附樹(shù)脂在天然產(chǎn)物活性成分分離方面的應(yīng)用日益廣泛，具有分離純化效果優(yōu)良，可反復(fù)再生使用和低成本的應(yīng)用特點(diǎn)[4-5]。本實(shí)驗(yàn)在前期的研究基礎(chǔ)上，以AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黃芩水提取物中總黃酮進(jìn)行富集純化，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定其中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，G1379A真空脫氣機(jī)，G1311A四元梯度泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315柱恒溫箱，G1315B二極管陣列檢測(cè)器；Agilent B 04 03色譜工作站；AE-240 電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；KH-400DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

黃芩苷(批號(hào)：110715-200815)、黃芩素(批號(hào)：111595-200604)和漢黃芩素(批號(hào)：111514-200403)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度均為98%以上。黃芩藥材購(gòu)自河北安國(guó)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室翟延君教授鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，0～15 min，A 24%；15～22 min，A 24%→39%；22～24 min，A 39%→44%，24 min后保持A 44%。檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。流速：1.0 mL· min-1。柱溫：30 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品和漢黃芩素對(duì)照品適量，置同一量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含黃芩苷22.4 μg、黃芩素21.0 μg和漢黃芩素10.3 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 黃芩水提取液的制備[6]

取黃芩藥材，加水煎煮3次，每次加水8倍量，每次煎煮40 min，濾過(guò)，合并3次煎液，即得黃芩水提取液。

2.4 供試樣品的制備

2.4.1 未純化供試品的制備 取“2.3”項(xiàng)下的水提取液，濃縮，水浴蒸干，置烘箱中70 ℃干燥至恒重，粉碎，即得。

2.4.2 純化供試品的制備[7]取“2.3”項(xiàng)下的水提取液，經(jīng)70 ℃水浴加熱后量取一定體積(6倍樹(shù)脂體積)，加入3%氯化鈉溶解后加于預(yù)先處理好的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂上，待吸附完全后，用蒸餾水沖洗至近無(wú)色，用80%乙醇(8倍樹(shù)脂體積)洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮，水浴蒸干，置烘箱中70 ℃干燥至恒重，粉碎，即得。

2.5 供試品溶液的制備

取純化供試品約0.05 g(未純化供試品約0.4 g)，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.6 色譜圖

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 黃芩HPLC色譜圖A-混合對(duì)照品；B-未純化供試品；C-純化供試品；1-黃芩苷；2-黃芩素；3-漢黃芩素Fig 1 HPLC chromatograms of Scutellaria baicalensis A-mixed reference substance; B-sample without purification; C-purified sample; 1-baicalin; 2-baicalein; 3-wogonin

2.7 線(xiàn)性范圍考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1.0，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜峰面積，進(jìn)樣量X(μg)與色譜峰面積Y經(jīng)線(xiàn)性回歸，得回歸方程為：黃芩苷Y=3 635.3X-0.584 1，r=0.999 9；黃芩素Y=6 100X-4.016 5，r=0.999 9；漢黃芩素Y=6 307.4X-2.554 4，r=0.999 9。黃芩苷在0.022 4～0.448 0 μg，黃芩素在0.021 0～0.420 0 μg，漢黃芩素在0.010 3～0.205 0 μg內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.8 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果峰面積值的RSD分別為黃芩苷0.29%、黃芩素0.24%、漢黃芩素0.34%，表明儀器精密度較好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取純化供試品細(xì)粉6份，分別制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的平均含量分別為26.81%，6.31%，2.05%，RSD分別為0.76%、0.48%、0.64%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一純化供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10 h測(cè)定峰面積，結(jié)果含量的RSD分別為黃芩苷0.32%、黃芩素0.51%、漢黃芩素1.34%，表明本品溶液10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的純化供試品0.025 g，共計(jì)6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(含黃芩苷1.30 mg·mL-1，黃芩素0.30 mg·mL-1，漢黃芩素0.100 4 mg·mL-1)5.0 mL，蒸干溶劑，按“2.5”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素平均回收率分別為97.3%、98.4%和98.1%，RSD分別為1.71%、2.05%和1.65%。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.12 樣品含量測(cè)定

取樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中3種黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

在供試品溶液的制備過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑、提取方法和提取時(shí)間進(jìn)行了考察，分別選用50%甲醇、甲醇和乙醇為提取溶劑，考察了超聲提取、加熱回流提取二種方法，并考察了超聲提取20，30，40 min黃芩苷等成分的提取率，結(jié)果以本實(shí)驗(yàn)所述方法為最佳提取方法。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The results of recovery test

表2 樣品中黃芩苷、黃芩素與漢黃芩素的含量測(cè)定結(jié)果(n=3，±s )Tab 2 Determination results of baicalin, baicalein and wogonin(n=3,±s )

表2 樣品中黃芩苷、黃芩素與漢黃芩素的含量測(cè)定結(jié)果(n=3，±s )Tab 2 Determination results of baicalin, baicalein and wogonin(n=3,±s )

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本實(shí)驗(yàn)考察了黃芩經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂純化供試品與未純化供試品的出膏率和3種黃酮的含量，結(jié)果未純化供試品的平均出膏率為48.51%，3種黃酮總含量為11.36%，純化供試品的平均出膏率為14.46%，3種黃酮總含量為36.52%。以上結(jié)果表明，大孔吸附樹(shù)脂可除去黃芩水提物中的大量雜質(zhì)，使出膏率大大降低，并可較好地富集黃芩藥材中的總黃酮類(lèi)成分。

REFERENCES

[1] Ch.P(2010)VolⅠ(中國(guó)藥典2010年版.一部)[S]. 2010: 282.

[2] WANG C M, LIU G, FEI Y, et al. Study on purifying technology for total flavonoids in Scutellaria baicalensis by macroporous absorption resin [J]. Chin Tradit Herb Drugs(中草藥), 2010, 41(1): 58-60.

[3] HOU X Z, ZHANG Z Q, YOU C X, et al. Determination of six constituents in Scutellaria baicalensis Georgi by HPLC [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)), 2012, 29(11): 1010-1014.

[4] YUAN G J, LONG L N. Separation of rosmarinic acid from Rosmarinus officinalis L. with macroporous absorption resin [J]. Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥), 2010, 21(1): 234-236.

[5] ZHANG X R, CUI B J, GUO W R. Study on extraction of active constituents of Yandeng dripping pills with macroporous adsorption resin [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)), 2011, 28(5): 440-442.

[6] XU J, CHEN Z X, YUAN C L. Optimization of extracting method for Scutellaria baicalensis in Xiexin dropping pills by orthogonal test [J]. Liaoning J Tradit Chin Med(遼寧中醫(yī)雜志), 2006, 33(6): 731.

[7] XU J, CHEN Z X, YUAN C L. Study on separation and purification of total flavonoids from Scutellaria baicalensis by the method of macroporous adsorption resin [J]. Chin Arch Tradit Chin Med(中醫(yī)藥學(xué)刊), 2006, 24(9): 1648-1649.

Determination of Three Kinds of Flavonoids in Scutellaria Baicalensis Purified by Macroporous Absorption Resin

YU Yan1, XU Jing2*, XIU Lili2, TIAN Yuan1
(1.The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning 110032, China; 2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning 110032, China)

OBJECTIVE To establish a method for determination of the content of baicalin, baicalein and wogonin in Scutellaria baicalensis purified by macroporous absorption resin by HPLC. METHODS The macroporous absorption resin AB-8 was used to separate and purify the total flavonoids in the water extract from Scutellaria baicalensis. The HPLC method was used to determine the content of baicalin, baicalein and wogonin. The analytical column was Agilent TC-C18(4.6 mm× 250 mm, 5 μm). The mobile phase was a mixture liquid of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid in water by gradient elution. The UV detector wavelength was 280 nm, the flow rate was 1.0 mL·min-1, and the column temperature was 30 ℃. RESULTS The linear ranges of baicalin, baicalein and wogonin were 0.022 4-0.448 0 μg(r=0.999 9), 0.021 0-0.420 0 μg(r=0.999 9), 0.010 3-0.205 0 μg(r=0.999 9), respectively. The average recoveries of the method for baicalin, baicalein and wogonin were 97.3% with RSD 1.71%, 98.4% with RSD 2.05% and 98.1% with RSD 1.65%, respectively. The average contents of baicalin, baicalein and wogonin in the water extract from Scutellaria baicalensis with macroporous absorption resin were 27.52%, 6.87% and 2.13%, and the average contents were 9.16%, 1.66% and 0.54% without purification. CONCLUSION The method is simple, accurate, sensitive and stable.

HPLC; macroporous absorption resin; baicalin; baicalein; wogonin

R284.2；R917.101

B

1007-7693(2013)10-1107-04

2012-08-06

遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(LS2010105)

于艷，女，博士生，主管中藥師 Tel: 18909816763 E-mail: yuyangirl@yahoo.com.cn*

徐晶，女，碩士，教授 Tel: (024)86291931 E-mail: 95142012@qq.com

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；大孔吸附樹(shù)脂；黃芩苷；黃芩素；漢黃芩素