微生物發(fā)酵羅非魚(yú)骨粉工藝條件的優(yōu)化

馬海霞，楊賢慶,*，李來(lái)好，陳勝軍，吳燕燕，楊 燕

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；2.國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300)

微生物發(fā)酵羅非魚(yú)骨粉工藝條件的優(yōu)化

馬海霞1,2，楊賢慶1,2,*，李來(lái)好1，陳勝軍1，吳燕燕1，楊 燕1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300；2.國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300)

采用乳酸菌對(duì)羅非魚(yú)骨粉進(jìn)行發(fā)酵，并對(duì)最適發(fā)酵條件進(jìn)行研究。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，羅非魚(yú)骨粉的最適發(fā)酵菌株為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，裝液量為30%，料液比為1:5(m/V)，最適糖類為葡萄糖，起始pH值自然；混合水平正交試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)游離Ca2+含量影響的主次順序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間＞葡萄糖用量＞接種量＞發(fā)酵溫度＞骨粉粒徑，其中發(fā)酵時(shí)間對(duì)游離Ca2+含量有顯著影響(P＜0.05)，最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間8d、接種量8%、葡萄糖用量5%、溫度37℃、骨粉粒徑＜0.075mm。

微生物；發(fā)酵；羅非魚(yú)；魚(yú)骨粉

鈣具有重要的生理功能，對(duì)維持生命活動(dòng)非常重要[1]。隨著人們生活水平的提高和健康保健意識(shí)的增強(qiáng)，各類人群在日常生活中越來(lái)越注重補(bǔ)鈣。動(dòng)物骨頭中除含有大量鈣質(zhì)外，還含有蛋白質(zhì)、脂肪、骨膠原、軟骨素、鐵、鋅、鎂、磷等營(yíng)養(yǎng)元素，是開(kāi)發(fā)骨源補(bǔ)鈣產(chǎn)品的良好資源。動(dòng)物骨頭中的鈣主要是以羥磷灰石晶體[Ca10(PO4)6(OH)2]和無(wú)定型磷酸氫鈣(CaHPO4)的形式存在，羥磷灰石晶體和無(wú)定型磷酸氫鈣被大量的膠原纖維緊密包裹，形成致密的組織不易被人體吸收利用，人體要以動(dòng)物骨頭為鈣源，就必須將這種致密的組織破壞。近年來(lái)，有國(guó)內(nèi)學(xué)者采用微生物對(duì)畜禽骨頭進(jìn)行發(fā)酵制備營(yíng)養(yǎng)液[2-7]，使其中結(jié)合態(tài)的鈣轉(zhuǎn)化為游離鈣，這有利于人體對(duì)鈣的吸收和鈣在人體內(nèi)的沉積，該法兼有酸解、酶解和生物轉(zhuǎn)化的共同作用，但是利用微生物發(fā)酵魚(yú)骨開(kāi)發(fā)補(bǔ)鈣產(chǎn)品還鮮少見(jiàn)諸報(bào)道。本研究以羅非魚(yú)魚(yú)頭、魚(yú)排為鈣源，通過(guò)篩選出合適的發(fā)酵菌株，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，開(kāi)發(fā)出一種補(bǔ)鈣營(yíng)養(yǎng)制劑，為魚(yú)類加工下腳料魚(yú)骨的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與菌種

魚(yú)頭、魚(yú)排由廣州市恒發(fā)水產(chǎn)有限公司提供。

鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度為(999±2)mg/L) 德國(guó)Merck公司；其他試劑均為分析純，所有用水均為超純水。

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei，GIM1.190，簡(jiǎn)寫(xiě)成Lc)，嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococus thermophiles，GIM1.83，簡(jiǎn)寫(xiě)成St)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum，GIM1.191，簡(jiǎn)寫(xiě)成Lp) 廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

MARS5微波消解器 美國(guó)CEM公司；AA240FS原子吸收分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；超純水儀 美國(guó)Millipore公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；明鑒SPX型智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；PB-10 pH計(jì) 德國(guó)Sartorius集團(tuán)；VULCAN 3-550馬弗爐 美國(guó)Neytech公司。

1.3 方法

1.3.1 魚(yú)骨粉制備

將魚(yú)頭、魚(yú)排斬碎，沸水煮約2h，然后撈出用自然水清洗干凈，于80℃烘約3.5h，粉碎、過(guò)篩后密封于干燥處保藏備用。

1.3.2 發(fā)酵菌株篩選

將羅非魚(yú)骨粉(粒徑：0.075～0.150mm)、水、葡萄糖分別按質(zhì)量分?jǐn)?shù)22.5%、67.5%、5%的比例配制成魚(yú)骨粉發(fā)酵液，魚(yú)骨粉和水的質(zhì)量占總發(fā)酵液質(zhì)量的90%(下同)，121℃滅菌15min，冷卻，無(wú)菌條件下分別接入5%的已活化2代的Lp、Lc、St種子液，于37℃培養(yǎng)。在發(fā)酵第0、1、2、3、4、5、6、7、8天取樣測(cè)定魚(yú)骨粉發(fā)酵上清液的pH值和總酸度。每個(gè)處理做3個(gè)平行，取平均值。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 發(fā)酵液起始pH值

將魚(yú)骨粉發(fā)酵液用稀鹽酸和NaOH溶液調(diào)節(jié)起始pH值分別至5.5、5.9、6.3、6.7、7.1、7.5，121℃滅菌15min，冷卻，無(wú)菌條件下分別接入5%的Lc種子液發(fā)酵8d，測(cè)定魚(yú)骨粉發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量。每個(gè)處理做3個(gè)平行，取平均值。

1.3.3.2 裝液量

在250mL的三角瓶中分別移入25、50、75、100、125mL(對(duì)應(yīng)的裝液量分別為10%、20%、30%、40%、50%)魚(yú)骨粉發(fā)酵液，pH值自然，121℃滅菌15min，冷卻，無(wú)菌條件下分別接入5%的Lc種子液發(fā)酵8d，測(cè)定魚(yú)骨粉發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量。每個(gè)處理做3個(gè)平行，取平均值。

1.3.3.3 料液比

按料液比(魚(yú)骨粉:水)分別為1:2、1:3、1:5、1:7、1:10配制不同魚(yú)骨粉發(fā)酵液，葡萄糖5%，裝液量均為30%，pH值自然，121℃滅菌15min，冷卻，無(wú)菌條件下分別接入5%的Lc種子液發(fā)酵8d，測(cè)定魚(yú)骨粉發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量。每個(gè)處理做3個(gè)平行，取平均值。

1.3.3.4 糖用量

分別添加5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖+乳糖(質(zhì)量比1:1)，配制成不同魚(yú)骨粉發(fā)酵液，料液比1:5，裝液量30%，pH值自然，121℃滅菌15min，冷卻，無(wú)菌條件下分別接入5%的Lc種子液發(fā)酵8d，測(cè)定魚(yú)骨粉發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量。每個(gè)處理做3個(gè)平行，取平均值。

1.3.4 混和水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-3,5,7]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間、接種量、葡萄糖用量、發(fā)酵溫度和骨粉粒徑是影響乳酸菌發(fā)酵動(dòng)物骨粉的重要因素，由前面單因素試驗(yàn)確定發(fā)酵菌株、起始pH值、裝液量、料液比和最適糖用量后，選擇發(fā)酵時(shí)間(A)、接種量(B)、葡萄糖用量(C)、發(fā)酵溫度(D)、骨粉粒徑(E)5個(gè)因素，以魚(yú)骨粉發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量為評(píng)定指標(biāo)，采用L18(6×36)對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 測(cè)定指標(biāo)

1.3.5.1 pH值和總酸度測(cè)定

pH值：取魚(yú)骨粉發(fā)酵液離心(3000r/min，5min)，取發(fā)酵上清液，用pH計(jì)測(cè)其pH值。

總酸度(以乳酸計(jì))：取魚(yú)骨粉發(fā)酵上清液約10.00g，以酚酞為指示劑，用0.1000mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點(diǎn)，記下所耗NaOH的體積，用下式[8]計(jì)算。

式中：V為滴定時(shí)NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量/mL；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/(mol/L)；k為乳酸的換算系數(shù)0.09；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.5.2 游離Ca2+含量測(cè)定

采用微波消解-火焰原子吸收分光光度法測(cè)定。樣品前處理：準(zhǔn)確吸取發(fā)酵上清液1mL，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入硝酸10mL，在微波消解儀中消解(功率800W，比例100%，升溫時(shí)間15min，消解溫度180℃，保持時(shí)間20min)。消解結(jié)束后，取出消解罐，冷卻，將消解液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯溶樣杯中，在電熱板上于180℃趕酸直至消解液為無(wú)色透明，冷卻，然后將其轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中用0.1% LaCl3定容，待測(cè)定。

儀器測(cè)定操作參數(shù)：波長(zhǎng)422.7nm，夾縫0.5nm，空氣流量13.5L/min，乙炔流量2.00L/min，燈電流10.0mA。

1.3.5.3 一般營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

蛋白質(zhì)：采用微量凱氏定氮法，參照GB 5009.5—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》執(zhí)行[9]；脂肪：采用索氏抽提法，參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》執(zhí)行[10]；鈣、鐵、鋅、鎂：采用火焰原子吸收法，參照GB 5413.21—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中鈣、鐵、鋅、鈉、鉀、鎂、銅和錳的測(cè)定》執(zhí)行[11]；磷：參照GB/T 5009.87—2003《食品中磷的測(cè)定》執(zhí)行[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚(yú)骨粉的基本成分

表1 羅非魚(yú)魚(yú)骨粉的基本成分Table1 Basic nutrition components in tilapia fishbone meal

如表1所示，羅非魚(yú)魚(yú)骨中鈣含量高達(dá)26.05%，蛋白質(zhì)、鈣、磷三者含量達(dá)到62.09%，其中鈣磷比約為1.9:1，是適合于人體對(duì)鈣吸收的比例[13]。

2.2 發(fā)酵菌株的篩選

圖1 3株乳酸菌的pH值和總酸度的變化Fig.1 Changes of pH and total acidity during the fermentation by three lactic acid bacteria

由圖1可知，與第0天相比，發(fā)酵第1天3種發(fā)酵上清液中的pH值下降幅度都明顯較大，隨后接種St的發(fā)酵液的pH值一直在5.20左右波動(dòng)；而分別接種Lp和Lc的發(fā)酵上清液的pH值則繼續(xù)下降，但下降幅度趨緩，發(fā)酵至第5天以后，接種Lp和Lc的發(fā)酵上清液的pH值分別在4.45和4.16左右波動(dòng)。pH值的這種變化趨勢(shì)與Tang等[14]的研究結(jié)果相似，他們采用7株乳酸菌分別發(fā)酵強(qiáng)化鈣的豆奶，與第0天相比也發(fā)現(xiàn)接種的7種豆奶的pH值在發(fā)酵第1天顯著下降(P＜0.05)，隨后下降幅度明顯減緩。在發(fā)酵至第2天以后在同一發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，接種Lc的發(fā)酵上清液pH值最低，接種Lp的次之，接種St的最高。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，3種發(fā)酵上清液的總酸度均有不同程度的上升。與pH值的變化趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)，在整個(gè)發(fā)酵期間，接種Lc的發(fā)酵上清液的總酸度一直明顯高于接種其他兩種乳酸菌的，接種St的發(fā)酵上清液中的總酸度最低。從發(fā)酵第5天起，3種發(fā)酵上清液的總酸度曲線均趨于平緩，表明這3種發(fā)酵液的總酸度增速減緩。乳酸菌利用魚(yú)骨粉中的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和添加的葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)代謝不斷產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸等有機(jī)酸，使發(fā)酵液中的總酸度升高，pH值降低。而在酸性環(huán)境中，魚(yú)骨粉中鈣離子溶解度會(huì)增大，更有利于吸收[15]。3株乳酸菌中，Lc的產(chǎn)酸性能最強(qiáng)，所以選取Lc作為發(fā)酵菌株。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵液起始pH值的影響

由圖2可知，對(duì)照(未調(diào)節(jié)pH值)中游離Ca2+含量最高，達(dá)到3.96mg/mL，調(diào)節(jié)起始pH值在5.5～7.5之間時(shí)，發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量在3.16～3.55mg/mL之間。不同批次羅非魚(yú)骨粉發(fā)酵液的初始pH值并不相同，而是在pH5.6～7.0范圍之內(nèi)變動(dòng)，這可能與羅非魚(yú)的養(yǎng)殖方式、捕獲季節(jié)、大小規(guī)格等因素有關(guān)。由于調(diào)節(jié)魚(yú)骨粉發(fā)酵液的起始pH值后，其發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量反而比對(duì)照的小，因此在后面的實(shí)驗(yàn)中無(wú)需調(diào)節(jié)魚(yú)骨粉發(fā)酵液pH值，即起始pH值自然。

2.3.2 裝液量的影響

圖3 裝液量對(duì)游離Ca2+含量的影響Fig.3 Effect of fermentation liquid volume on free Ca2+content

由圖3可知，裝液量為40%和50%時(shí)，發(fā)酵上清液中的游離Ca2+含量明顯小于其他3組裝液量；裝液量分別為10%、20%、30%時(shí)，其發(fā)酵上清液中的游離Ca2+含量則分別為3.97、4.06mg/mL和4.04mg/mL，基本無(wú)差異。Lc是兼性好氧菌，裝液量大很可能影響了魚(yú)骨粉發(fā)酵液中的溶氧量，從而影響Lc的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)酸能力，進(jìn)而影響魚(yú)骨粉中結(jié)合態(tài)鈣的溶出。但裝液量大可提高設(shè)備的利用率，提高發(fā)酵上清液產(chǎn)量。綜合考慮，最適裝液量為30%。

2.3.3 料液比的影響

由圖4可知，料液比為1:2時(shí)其發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量最高，達(dá)到3.42mg/mL，料液比分別為1:3、1:5時(shí)其發(fā)酵上清液中的游離Ca2+含量分別為3.11、3.10mg/mL，基本無(wú)差異；而料液比分別為1:7、1:10時(shí)其發(fā)酵上清液中的游離Ca2+含量要略少，分別為2.84、2.85mg/mL，也基本無(wú)差異。發(fā)酵液總質(zhì)量相同，料液比越大(即魚(yú)骨粉用量越大)，發(fā)酵后離心所獲得的上清液就越少，雖然其游離Ca2+含量質(zhì)量濃度較高，但游離Ca2+總量卻不一定與其質(zhì)量濃度一致。綜合考慮魚(yú)骨粉用量和游離Ca2+總含量，最適料液比為1:5。

圖4 料液比對(duì)游離Ca2+含量的影響Fig.4Effect of meal-water ratio on free Ca2+content

2.3.4 糖種類的影響

圖5 糖種類對(duì)游離Ca2+含量的影響Fig.5 Effect of sugar addition on free Ca2+content

由圖5可知，與對(duì)照相比，添加糖類可明顯提高發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量，但添加的糖種類不同，其游離Ca2+含量也會(huì)有差異。發(fā)酵結(jié)束后，添加不同糖類的發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量的大小順序?yàn)椋浩咸烟牵酒咸烟?乳糖＞乳糖＞蔗糖。葡萄糖為魚(yú)骨粉乳酸菌發(fā)酵的最適碳源。

2.4 混合水平正交試驗(yàn)結(jié)果分析

混合水平正交試驗(yàn)(L18(6×36))極差分析結(jié)果和方差分析結(jié)果分別見(jiàn)表2、3。由表2可以直觀看出，對(duì)發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量影響的因素順序是A＞C＞B＞D＞E，5個(gè)因素的最優(yōu)組合為A6B3C2D2E3，即發(fā)酵時(shí)間8d、接種量8%、葡萄糖用量5%、溫度37℃、骨粉粒徑＜0.075mm；由表3可知，因素A對(duì)游離Ca2+含量有影響顯著(P＜0.05)。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在此最優(yōu)組合條件下，發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量為5.86mg/mL。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果Table2 Design and results of orthogonal tests

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table3 Analysis of variance for orthogonal tests

3 結(jié) 論

在羅非魚(yú)骨粉發(fā)酵液中，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)的產(chǎn)酸性能要優(yōu)于植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和嗜熱乳酸鏈球菌(Streptococus thermophiles)，是最適發(fā)酵菌株；裝液量、料液比對(duì)魚(yú)骨粉發(fā)酵上清液中的游離Ca2+含量有一定影響，獲得最適裝液量30%、料液比1:5；與對(duì)照相比，是否添加糖及糖的種類對(duì)游離鈣Ca2+含量影響較大，不同糖類對(duì)游離Ca2+含量的影響大小順序?yàn)椋浩咸烟牵酒咸烟?乳糖＞乳糖＞蔗糖，葡萄糖為魚(yú)骨粉乳酸菌發(fā)酵的最適碳源。

干酪乳桿菌發(fā)酵羅非魚(yú)骨粉，可明顯提高魚(yú)骨粉發(fā)酵液中的游離Ca2+含量。采用混合水平正交試驗(yàn)(L18(6×36))優(yōu)化發(fā)酵工藝條件后，在發(fā)酵時(shí)間8d、接種量8%、葡萄糖用量5%、發(fā)酵溫度37℃、骨粉粒徑＜0.075mm條件下，發(fā)酵上清液中游離Ca2+含量為5.86mg/mL，遠(yuǎn)高于牛奶中的Ca2+含量(1.20mg/mL)。

乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酮酸、琥珀酸、富馬酸等有機(jī)酸[16]和游離氨基酸、多糖、酶等代謝物，使魚(yú)骨中的鈣由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，這是酸解、酶解和生物轉(zhuǎn)化等的協(xié)同作用效果。據(jù)報(bào)道，動(dòng)物骨頭經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后還會(huì)產(chǎn)生一些功能性物質(zhì)[17]。魚(yú)骨中除鈣外，還含有大量的Fe、Zn、Mg、P等礦物質(zhì)，因此，乳酸菌在發(fā)酵羅非魚(yú)骨粉過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，如有機(jī)酸、游離氨基酸、游離脂肪酸和多糖等的種類及其含量的變化規(guī)律，以及代謝產(chǎn)物對(duì)魚(yú)骨中Ca、Fe、Zn、Mg、P等含量的影響，魚(yú)骨發(fā)酵補(bǔ)鈣營(yíng)養(yǎng)制劑的功能評(píng)價(jià)等都是下一步研究分析的問(wèn)題。

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Optimization of Fermentation Process for Tilapia Bone Meal

MA Hai-xia1,2，YANG Xian-qing1,2,*，LI Lai-hao1，CHEN Sheng-jun1，WU Yan-yan1，YANG Yan1
(1. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；2. National R&D Center for Aquatic Product Processing, Guangzhou 510300, China)

Current studies have revealed that the content of free calcium in fermented fishbone meal with lactic acid bacterial (LAB) was significantly increased. In order to improve fermentation technology, the optimal fermentation conditions for tilapia bone meal were explored. The single factor experimental results indicated that the optimal LAB species was Lactobacillus casei, and the optimal fermentation liquid volume was 30%, optimal meal-liquid ratio was 1:5 (m/V) and optimal saccharide was glucose at natural pH. The orthogonal test showed that the factors for influencing free calcium content were: fermentation period＞glucose dosage＞inoculation amount＞fermentation temperature＞meal granule size, in which the fermentation period revealed the most obvious impact on free calcium content (P＜0.05). The optimal fermentation conditions were fermentation duration of8 days, inoculation amount of 8%, glucose amount of 5%, fermentation temperature of 37 ℃, and bone meal granule size less than 0.075 mm.

microorganism；fermentation；tilapia；fishbone meal

TS254.9

A

1002-6630(2013)03-0193-05

2011-10-16

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-49)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011A020102005；2009A020700004)；茂名市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011A01002)

馬海霞(1977—)，女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與綜合利用。E-mail：haixiam@gmail.com

*通信作者：楊賢慶(1963—)，男，研究員，本科，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。E-mail：yxqgd@163.com