肝細(xì)胞癌患者血清m iR-221和m iR-122的檢測(cè)及其臨床意義

雷永紅，呂文平，王 海

（1.解放軍總醫(yī)院海南分院住院病案管理科，海南三亞572000；2.解放軍總醫(yī)院肝膽外科，北京100853；3.解放軍總醫(yī)院海南分院檢驗(yàn)中心，海南三亞572000）

·論 著·

肝細(xì)胞癌患者血清m iR-221和m iR-122的檢測(cè)及其臨床意義

雷永紅1，呂文平2，王 海3

（1.解放軍總醫(yī)院海南分院住院病案管理科，海南三亞572000；2.解放軍總醫(yī)院肝膽外科，北京100853；3.解放軍總醫(yī)院海南分院檢驗(yàn)中心，海南三亞572000）

目的探討檢測(cè)血清RNA中miR-221和miR-122在肝細(xì)胞癌患者血清中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR）對(duì)比檢測(cè)72例肝細(xì)胞癌患者、48例肝良性疾病患者和60例正常對(duì)照組人員血清中miR-221和miR-122水平。分析miR-221和miR-122的表達(dá)程度與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果肝細(xì)胞癌患者血清miR-221和miR-122明顯高于良性肝病和正常對(duì)照組（P＜0.05）。肝癌患者血清miR-221和miR-122表達(dá)的高低與肝硬化、甲胎蛋白、腫瘤大小、病理分化、臨床病理TNM分級(jí)有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論血清miR-221和miR-122與肝癌的臨床病理特征關(guān)系密切，可能是肝細(xì)胞癌新的早期檢測(cè)指標(biāo)。

肝腫瘤；血清；微RNAs

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，在全球癌癥病死率中居第3位。早期發(fā)現(xiàn)和診斷HCC成為目前治療的關(guān)鍵［1］。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）水平的測(cè)定是目前最常用的診斷肝細(xì)胞癌血清學(xué)指標(biāo)，但臨床上仍

有約30％HCC患者血清AFP含量在正常范圍內(nèi)，臨床上極易漏診［2－3］。因此，臨床科研人員一直試圖尋找新的腫瘤標(biāo)志物來(lái)輔助診斷。miRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度20～25nt的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，它通過(guò)與其目標(biāo)mRNA分子的3＇UTR完全或不完全互補(bǔ)匹配，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯。miRNA調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生理病理過(guò)程［4－6］。最近的研究［7－9］表明，miR-221和miR-122的表達(dá)在HCC患者癌組織和血清中會(huì)出現(xiàn)明顯的變化，而這種變化與HCC的發(fā)生關(guān)系密切。本文通過(guò)檢測(cè)HCC患者血清miR-221和miR-122表達(dá)水平，探討miR-221和miR-122在HCC診斷和治療中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1．1 一般資料：收集解放軍總醫(yī)院2010年8月—2011年6月接受手術(shù)治療的72例肝癌患者血清樣本。所有患者均經(jīng)過(guò)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)，其中男性48例，女性24例，年齡25～68歲，平均47.2歲。另取48例肝良性?。ǜ窝芰?6例，肝囊腫23，肝腺瘤9例，男性30例，女性18例，年齡34～62歲，平均44.7歲）和60例正常人（男性37例，女性23例，年齡35～58歲，平均45.6歲）血清作為對(duì)照。所有血清標(biāo)本立即放入液氮中凍存并于－80℃冰箱保存。

1．2 分離收集血清：空腹采集靜脈血3mL，將其置于室溫下1h。然后2 000r/min離心15min，取上清（血清）置于新1.5mL微量離心管。置于－80℃冰箱待測(cè)。

1．3 總RNA的提?。翰捎肨rizol法提取血清總RNA。NanoDrop?ND-1000測(cè)定RNA濃度并評(píng)估純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度及完整性。將提取出的RNA樣品保存于－80℃冰箱以備下一步實(shí)驗(yàn)使用。

1．4 miRNA的cDNA合成：制備RT混合反應(yīng)液，Total RNA 0.3μg，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5mmol/L each）2μL，10×RT Buffer 2μL，RT特異引物（1μmol/L）0.5μL，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶（10U/uL）2μL，RNA酶抑制劑（40U/μL）0.3μL，加入無(wú)RNA酶水至總體積20μL。在Gene Amp PCR System 9700進(jìn)行RT反應(yīng)，16℃，30min；42℃水浴，40min；85℃水浴，5min反應(yīng)結(jié)束后，冰上冷卻5min，－20℃保存。

1．5 Realtime PCR反應(yīng)：以U6為內(nèi)參基因，采用10μL的反應(yīng)體系，PCR引物序列見表1。dNTP（2.5mmol/L each）1.0μL，10×PCR緩沖液1.0μL，MgCl2溶液0.6μL，Taq聚合酶0.5U，Sybergreen I終濃度0.25×，10μmol/L PCR特異引物F 0.4μL，10μmol/L的PCR特異引物R 0.4μL，2×ROX Reference Dye 0.2μL。反應(yīng)條件，95℃，3min；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，15s；60℃，30s；72℃，30s），重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用2－ΔΔCT法（CT值定義為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）分析miR-221和miR-122表達(dá)的相對(duì)變化。

表1 Real time RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used for real-tim ePCR analysis

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 HCC患者與肝良性病、正常人血清miR-221和miR-122的表達(dá)水平：以U6為內(nèi)參基因，HCC患者血清中miR-221和miR-122的表達(dá)水平（分別為10.58±3.47、2.3±1.09）較肝良性?。?.34±0.53、0.81±0.33）和正常人（1.29±0.32、0.78±0.31）明顯上調(diào)（P＜0.01）。而miR-221和miR-122在肝良性病和正常人血清中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2．2 血清miR-221和miR-122與HCC臨床病理特征間的關(guān)系：HCC患者血清miR-221和miR-122的表達(dá)水平與腫瘤的大小、術(shù)前AFP水平、肝硬化、病理分化、癌栓、TNM分期有關(guān)（P＜0.05），而與患者的性別、年齡無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理指標(biāo)的HCC患者血清m iR-221和m iR-122表達(dá)水平Table 2 Serum m iR-221 and m iR-122 of HCC patients w ith different clinical and pathologic features ±s）

表2 不同臨床病理指標(biāo)的HCC患者血清m iR-221和m iR-122表達(dá)水平Table 2 Serum m iR-221 and m iR-122 of HCC patients w ith different clinical and pathologic features ±s）

t P Gender Male Female Clinical and pathologic features n miR-221 t P miR-122 0.715＞0.05 Age（years）＜50≥50 48 24 10.40±3.25 10.64±3.13 0.725＞0.05 2.31±1.04 2.26±1.09 33 39 10.36±3.27 10.59±3.41 0.963＞0.05 2.28±1.08 2.34±1.11 0.844＞0.05 Tumor size≤5cm＞5cm 40 32 13.19±4.48 2.518＜0.05 1.27±0.64 3.57±1.37 3.062＜0.05 8.85±2.76 Tumor grade Well differentiated Moderately differentiated Poorly differentiated 30 28 14 8.43±3.29 9.77±3.73 16.28±5.84 2.154＜0.05 1.82±0.69 2.08±0.91 3.83±1.74 2.013＜0.05 Hepatic cirrhosis Positive Negative 41 31 11.72±3.63 9.65±3.41 2.385＜0.05 3.06±1.45 1.38±0.59 3.147＜0.05 Preoperative levels of afp（μg/L）＜20≥20 18 54 11.25±4.76 2.549＜0.05 2.09±1.05 2.42±0.93 2.238＜0.05 7.95±3.39 TNM stageⅠⅡⅢ23 38 11 7.34±2.95 10.34±4.84 16.70±7.26 2.487＜0.05 1.43±0.66 2.53±1.07 3.71±1.78 2.870＜0.05 Cancer embolus Positive Negative 23 49 12.08±5.52 9.69±4.03 2.307＜0.05 3.25±1.62 1.92±0.83 2.931＜0.05

2．3 血清miR-221和miR-122在HCC中的診斷價(jià)值：以健康人血清miR-221和miR-122檢測(cè)值的±2s作為正常人的臨界值（cut-off值）。miR-221診斷HCC的敏感度為87.22％，特異度為78.05％，準(zhǔn)確度為85.47％；而miR-122診斷HCC的敏感度為80.71％，特異度為88.16％，準(zhǔn)確度為83.69％。

3 討 論

miRNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著極為密切的關(guān)系，在腫瘤中的miRNA表達(dá)往往具有組織特異性。外周血中含有豐富的穩(wěn)定表達(dá)的miRNA。且血清miRNA由于其內(nèi)源性的結(jié)構(gòu)特性決定了其具有對(duì)抗核糖核酸酶的能力，且在經(jīng)歷反復(fù)凍融、pH值改變等情況下，其表達(dá)仍能維持穩(wěn)定［10］。新的研究［11－13］發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤相關(guān)的miRNA在腫瘤患者血清中出現(xiàn)異常變化，而且這種改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。因此，推測(cè)miRNA可能是一個(gè)理想的基于血液的腫瘤檢測(cè)評(píng)估指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。

miR-122是肝臟中特異性高表達(dá)的一種miRNA，其前體定位于人類18號(hào)染色體18q21.31上［14］。生理狀態(tài)下，miR-122在調(diào)控肝臟的細(xì)胞發(fā)育、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、參與肝細(xì)胞應(yīng)激應(yīng)答等生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。肝癌細(xì)胞中miR-122的表達(dá)明顯下調(diào)，其在肝癌的發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出抑癌基因的功能。Igf1R、ADAM-10、Bcl-w、Cyclin G1、Wnt1、β-catenin和TCF-4等致癌基因被證實(shí)為miR-122的下游靶基因，通過(guò)人工上調(diào)miR-122的表達(dá)則能明顯抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［15－17］。肝癌患者血清中的miR-122的表達(dá)卻是明顯升高的，這種反常性的升高可能與惡性腫瘤對(duì)肝臟造成的損害有關(guān)，并且其表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)，提示血清miR-122檢測(cè)是診斷PHC較為有效的方法［9］。

miR-221是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA。其基因定位于X染色體P11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內(nèi)。有研究［18－20］表明，miR-221在許多惡性腫瘤細(xì)胞（如肝癌、胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌等）中的表達(dá)明顯上調(diào)，表現(xiàn)為一種“通用”的促癌基因。其機(jī)制可能通過(guò)對(duì)p27、CDKN1C/p57、PUMA、Bm f、c-kit、DDIT4等基因的調(diào)控來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和分化，抑制細(xì)胞凋亡，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。尤其值得關(guān)注的是，肝癌患者血清中miR-221的表達(dá)上調(diào)，而這種改變與肝癌的臨床病理特征、患者的總體生存率有關(guān)［8］。

本研究采用Realtime PCR技術(shù)對(duì)72例HCC患者血清中miR-221和miR-122的表達(dá)情況，并與48例肝良性病、60例正常人血清進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示HCC患者血清miR-221和miR-22的表達(dá)水平明顯高于肝良性病和60例正常人。與HCC臨床病理因素分析顯示，血清miR-221和miR-122的表達(dá)水平與患者的性別、年齡無(wú)明顯關(guān)系，而與與腫瘤大小、肝硬化、腫瘤分化、術(shù)前AFP水平、癌栓、TNM分期相關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［8－9］。提示血清miR-221

和miR-122的高表達(dá)與HCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，也間接提示其可能與HCC癌的不良預(yù)后有關(guān)，但這需要大樣本研究和長(zhǎng)時(shí)間的隨訪才能得到證實(shí)。目前尚無(wú)正常人血清miR-221和miR-122 cut-off值。我們以健康人血清miR-221和miR-122檢測(cè)值的±2s作為正常人的cut-off值。結(jié)果顯示miR-221診斷HCC的敏感度為87.22％，特異度為78.05％，準(zhǔn)確度為85.47％；而miR-122診斷HCC的敏感度為80.71％，特異度為88.16％，準(zhǔn)確度為83.69％。表明血清miR-221和miR-122在早期診斷HCC方面具有的優(yōu)勢(shì)和潛力［21］。

然而，目前血清miR-221和miR-122作為HCC檢測(cè)標(biāo)記物尚處于早期研究階段，還存在一些亟待解決的問題：①目前血清miRNA的檢測(cè)尚需標(biāo)準(zhǔn)化；②miRNA作為HCC血清標(biāo)志物，其參考值范圍還需進(jìn)一步論證；③臨床試驗(yàn)樣本量普遍較少，缺乏長(zhǎng)期追蹤隨訪資料。

總之，miR-221和miR-122是新發(fā)現(xiàn)的肝腫瘤標(biāo)志物，其血清表達(dá)水平與HCC的臨床病理特征關(guān)系密切。隨著對(duì)miRNA在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用更深入的了解，臨床上對(duì)于血清miRNA的檢測(cè)不僅可以提高肝臟癌變的早期診斷，也可以通過(guò)anti-miRNA寡核苷酸、miRNA海綿、miRNA模擬物等途徑調(diào)控體內(nèi)腫瘤相關(guān)miRNA的表達(dá)，可能成為一種治療癌癥的新途徑［22］。

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（本文編輯：趙麗潔）

DETECTION OF m iR-221 AND m iR-122 IN SERUM OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA PATIENTS AND CLINICAL SIGNIFICANCE

LEIYonghong1，LVWenping2，WANG Hai3
（1．Department of Inpatients＇Medical Record，Hainan Branch Affiliated to General Hospital of PLA，Sanya 572000，China；2．Department of Hepatobiliary Surgery，PLAGeneral Hospital，Beijing 100853，China；3．Inspection
Center，Hainan Branch Affiliated to General Hospital of PLA，Sanya 572000，China）

Objective To investigates the expression of miR-221 and miR-122 in serum of hepatocellular carcinoma（HCC）patients，as well as their clinical significance.MethodsThe blood samples were collected from 72 patients with HCC，48 patients with benign disease and 60 normal subjects.The expression levels of miR-221and miR-122 in the serum were measured by reverse transcription polymerase chain reaction.The correlations of miR-221and miR-122 expression to the clinicopathological featureswere analyzed.ResultsHCC patients had significantly highermiR-221 and miR-122 levels than benign diseases and healthy controls.The expression level of serum miR-221 and miR-122 had a close correlation with liver cirrhosis，alpha fetoprotein level，tumor size，tumor thrombi，histological differentiation，tumor nodemetastasis classification（P＜0.05）.ConclusionThe expression of miR-221 and miR-122 in serum had close correlations with the clinicopathologic features of hepatocellular carcinoma，indicating that miR-221 and miR-122 can be used as potential markers for HCC.

liver neoplasms；serum；microRNAs

R735.7

A

1007-3205（2013）05-0522-04

2013－03－18；

2013－04－01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30772493）

雷永紅（1967－），女，河北曲陽(yáng)人，解放軍總醫(yī)院海南分院主管技師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事住院病案管理研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.010