如何避免ELISA法測HBSAg弱陽性漏檢

賈曉偉

吉林省通榆縣第一醫(yī)院檢驗科，吉林 通榆 137200

如何避免ELISA法測HBSAg弱陽性漏檢

賈曉偉

吉林省通榆縣第一醫(yī)院檢驗科，吉林 通榆 137200

本方法對乙肝表面抗原檢測結(jié)果處于灰?guī)^(qū)（高值陰性），酶標(biāo)儀判讀吸光度CD值0.095－0.11之間20例結(jié)果進(jìn)行分析。其中50%為乙肝表面抗原陽性及弱陽性。15%三個月后復(fù)檢轉(zhuǎn)為陽性。35%為乙肝表面抗原陰性。因此，認(rèn)為ELISA方法應(yīng)嚴(yán)格操作，防止陽性漏檢。

乙肝表面抗原，弱陽性結(jié)果，防止漏檢

在用ELISA方法檢測乙肝表面抗原（HBSAg）時，發(fā)現(xiàn)有些檢測結(jié)果處于灰?guī)^(qū)。目測判定為陰性，若用酶標(biāo)儀判讀，測定值等于或接近Cut－off值，為探討“高值陰性”的確切意義，本室觀察了測定值在0.095－0.11標(biāo)本20例，對其結(jié)果進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源 檢測門診及住院患者HBsAg，記錄其檢測結(jié)果，收集測定值在0.095－0.11之間標(biāo)本20例。

1.2 試劑 上海科華有限公司HBsAg試劑盒。

1.3 方法 ELISA法。

2 結(jié)果

測定結(jié)果見下表

三次測定平均結(jié)果

20例中有10例經(jīng)反復(fù)檢測，HBsAg測定值＞Cut－off值（0.105）為陽性。7例轉(zhuǎn)為低值陰性，仍有3例介于Cut－off附近。經(jīng)跟蹤復(fù)檢測定值＞Cut－off值轉(zhuǎn)為陽性。

3 討論

筆者認(rèn)為，人體感染HBV后，HBsAg為較先出現(xiàn)的病毒標(biāo)志物，從感染到血中出現(xiàn)HBsAg間隔時間與感染的途徑和數(shù)量有關(guān)，一般在感染后29～43天或18～84天出現(xiàn)，如數(shù)量大則間隔時間短，約2－3周。如數(shù)量小則間隔時間長，可達(dá)3～4個月，甚至半年。因此，HBsAg在感染后達(dá)到可檢出水平，有一個高值陰性、弱陽性、強(qiáng)陽性的過程，“高值陰性”者中包含一部分陽性結(jié)果，應(yīng)反復(fù)檢測，有條件應(yīng)跟蹤復(fù)檢連續(xù)觀察半年。

ELISA方法測HBsAg的滴度（濃度）高低與肝炎病情輕重成反比。經(jīng)臨床觀察，在急性肝炎中暴發(fā)性肝炎滴度最低，慢性肝炎中慢性活動性肝炎滴度最低，肝臟損壞與機(jī)體對抗原的免疫反應(yīng)，而不是感染病毒的數(shù)量。一般講免疫反應(yīng)低，則肝細(xì)胞損傷輕，HBsAg呈高滴度，反之則呈低滴度。因此，HBsAg可以時高時低，時陰時陽。在此時，弱陽性標(biāo)本檢測顯得尤為重要，“高值陰性”也應(yīng)引起高度重視。初檢時，“高值陰性”者中很有可能是一些臨床癥狀較重的暴發(fā)性及活動性肝炎患者。此種情況單項HB-sAg很難判定，應(yīng)結(jié)合HBsAg、HBeAg、HBcAg、HBcAg－ IgM綜合判定，如果其它幾項呈陽性，對此時灰色區(qū)域的HBsAg應(yīng)慎重報告。

ELISA方法測HBsAg影響因素很多，應(yīng)用國產(chǎn)試劑盒ELISA陽性漏檢率為3%，其中窗口期占90%，血液中濃度紙、HBV株的變異、非典型血清轉(zhuǎn)陽和人為差錯共占10%。在實際工作中如何排除ELISA影響因素，提高檢測的靈敏度。我們認(rèn)為，影響測定，首先考慮到的就是濃度漏檢HOOK現(xiàn)象，以前用國產(chǎn)試劑盒檢測HBsAg多為“一步法”，即將待測物與酶標(biāo)記物同時加入包被好的反應(yīng)孔中，溫育、洗滌、顯色。而現(xiàn)在 “兩步法”是先將待測物加入包被好的反應(yīng)孔內(nèi)，經(jīng)溫育、抗體牢固結(jié)合。洗滌掉游離的抗原、抗體和非特異性蛋白等污物。再加酶標(biāo)記物溫育，形成 “夾心復(fù)合物”洗滌，顯色。而現(xiàn)在 “兩步法”檢測中高濃度的HBsAg只與包被的固相抗－HBs“飽和性結(jié)合”，形成抗原抗體復(fù)合物，多余的未結(jié)合的游離HBsAg第一次洗滌時被洗掉，隨后加入酶標(biāo)物就能形成“雙抗體夾心復(fù)合物”加底物顯色試驗中發(fā)現(xiàn) “一步法”檢測HBsAg陰性的血術(shù)經(jīng)“兩步法”檢測HBsAg確有陽性。采取“兩步法”可以削弱HOOK現(xiàn)象降低HBsAg的陽性漏檢率。

另外，對ELISA判斷在灰色區(qū)域范圍的人群除行綜合試驗確診是否HBsAg陽性也可建議進(jìn)行FQ－PCR以判斷是否為乙肝患者。因為我們知道HBV中的Dane顆粒僅占0.2%，而小球型顆粒及管型顆粒占98%以上，其僅表達(dá)HBsAg而不含DNA，所以，對于ELISA檢出HBsAg陽性并不表明HBV、DNA陽性，因FQ－PCR對實驗室條件要求較高，現(xiàn)在基層醫(yī)院尚未普及?；鶎痈髦行♂t(yī)院還在普遍應(yīng)用ELISA方法。

ELISA方法雖有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但它對操作要求較高。我們要想避免操作中的人為技術(shù)差錯，必須按ELISA操作規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)操作。筆者認(rèn)為ELISA方法則HBsAg必須每板隨測定值1ng/ml臨界值質(zhì)控品。它是做為試劑盒中第三個對照品，可以靈敏反應(yīng)出試劑盒的檢出水平，確保弱陽性標(biāo)本不漏檢，同時也是反應(yīng)結(jié)束的判定標(biāo)準(zhǔn)。只要從試劑平衡、回樣、保溫、漂浮、洗滌、顯色等每一步驟都嚴(yán)格控制，其結(jié)果重復(fù)性很好。

當(dāng)然，“高值陰性”中也有相當(dāng)比例的陰性結(jié)果，多為操作中洗板不凈等因素所致。

R392.11

A

1007－8517（2013）10－0125－01

2013.04.19）