兩種硬性接觸鏡護(hù)理液除蛋白作用及生物相容性的比較研究△

翁郁華 李伶俐 羅麗 南開輝 金婉卿 陳云云

兩種硬性接觸鏡護(hù)理液除蛋白作用及生物相容性的比較研究△

翁郁華 李伶俐 羅麗＊南開輝 金婉卿 陳云云

目的將一種硬性接觸鏡護(hù)理液（RCLS）與現(xiàn)有同類產(chǎn)品MeniconProgent進(jìn)行除蛋白作用、對(duì)人眼角膜上皮細(xì)胞毒性及動(dòng)物刺激性的比較，綜合評(píng)價(jià)其生物相容性。方法細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用人眼角膜上皮細(xì)胞，分別用培養(yǎng)液、RCLS、MeniconProgent作用細(xì)胞不同時(shí)間，以WST-1試劑檢測(cè)細(xì)胞存活率；取硬鏡RGP鏡片在2 mg/mL溶菌酶溶液中浸泡、吸附24 h，分別用RCLS和MeniconProgent浸泡吸附后的鏡片，再用BCA法測(cè)定溶液中的蛋白含量；刺激性實(shí)驗(yàn)以新西蘭白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別取0.1mL RCLS或MeniconProgent滴入兔眼，記錄眼損傷；取沾有RCLS和MeniconProgent的紗布?jí)K敷貼于兔背部裸露皮膚處，敷貼后評(píng)價(jià)皮膚損傷程度。結(jié)果RCLS對(duì)硬鏡表面吸附的溶菌酶有83.159％的除去率，相對(duì)于MeniconProgent的85.180％，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MeniconProgent接觸15 min后即對(duì)人角膜上皮細(xì)胞有溶解作用，細(xì)胞毒性大，對(duì)兔眼有刺激，對(duì)皮膚也有輕度刺激，而RCLS作用人角膜上皮細(xì)胞1 h，細(xì)胞存活率＞80％，對(duì)兔眼及皮膚均無刺激。結(jié)論RCLS在細(xì)胞毒性及刺激性方面的生物相容性優(yōu)于MeniconProgent。（中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2013，13：100-104）

硬性接觸鏡；護(hù)理液；除蛋白作用；生物相容性

接觸鏡又稱隱形眼鏡，有軟鏡和硬鏡之分。硬性接觸鏡用于矯正屈光不正可以追溯到20世紀(jì)50年代。與軟鏡相比，硬鏡的優(yōu)點(diǎn)在于光學(xué)性能好、以矯正角膜散光、控制近視屈光度的增長(zhǎng)［1］，用于矯正原發(fā)性角膜散光和各種繼發(fā)性角膜散光（外傷所致的角膜散光、圓錐角膜、準(zhǔn)分子激光屈光性切削術(shù)后散光等）［2］。

目前國(guó)內(nèi)臨床上應(yīng)用的硬鏡護(hù)理液種類很少，而且價(jià)格昂貴。由本院研制的一種硬性接觸鏡護(hù)理液（rigid contact lens care solution，RCLS），主要成分為三氟乙酸、聚氨丙基雙胍，主要功能為除蛋白及清潔等。本文從除蛋白作用、細(xì)胞毒性以及動(dòng)物刺激性方面，將其與同類產(chǎn)品美尼康清潔、除蛋白型硬鏡護(hù)理液產(chǎn)品MeniconProgent作對(duì)比，評(píng)價(jià)RCLS的部分生物相容性，供臨床應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與材料 RCLS為無色透明液體，pH值為6.8～8.5，本院研制；MeniconProgent由日本美尼康株式會(huì)社提供；氟硅丙烯酸酯角膜接觸鏡由溫州欣視界科技有限公司提供。

1.1.2 試劑 溶菌酶（＞20KU，sigma）；2，4-二硝基氯苯（AR，西亞試劑）；生理鹽水注射液（浙江康樂藥業(yè)股份有限公司）；WST-1細(xì)胞毒性測(cè)試試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；DMEM/F12、磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、0.05％Trypsin-EDTA（gibco）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭大白兔12只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄各半，由丹陽市光明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)：3200002369。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人眼角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng) 所用細(xì)胞系為ATCC CRL-11135 HCE-2，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％FBS、5μg/mL胰島素，10 ng/mL EGF，100μg/mL青-鏈霉素的DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％～90％融合時(shí)以1∶3～1∶10比例傳代培養(yǎng)［3］。

1.2.2 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)方法［4］HCE-2細(xì)胞融合后用0.05％Trypsin-EDTA消化5 min，相對(duì)離心力為400×g離心3 min。用含2％FBS的DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)液配制終濃度為5×104個(gè)/mL的細(xì)胞液，接種于96孔板，每孔100μL。

WST-1法檢測(cè)細(xì)胞活性：實(shí)驗(yàn)分3組，正常對(duì)照組、RCLS組、MeniconProgent組（含A液和B液，使用時(shí)A液與B液等量混合）；每組設(shè)5平行，共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)：15 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h。細(xì)胞培養(yǎng)18 h貼壁后，棄去原培養(yǎng)液，分別換成100μL的RCLS和MeniconProgent，對(duì)照組為等量新鮮培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)一定時(shí)間后用WST-1試劑檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)孔在450 nm吸光度（optical density，OD）值。計(jì)算細(xì)胞存活率=樣品吸光度值/對(duì)照組吸光度值。

1.2.3 除蛋白功效實(shí)驗(yàn)方法 氟硅丙烯酸酯角膜接觸鏡27片，去離子水洗凈烘干備用。配制2mg/mL溶菌酶溶液（溶液1），加入24孔板中，每孔2 mL，每孔放入3片鏡片。模擬鏡片在人眼內(nèi)位置凸面向上放置，根據(jù)人眼眼表溫度，將培養(yǎng)板置于34℃恒溫孵育24 h［5］。

BCA法測(cè)定蛋白濃度。實(shí)驗(yàn)分3組：對(duì)照組、RCLS組、MeniconProgent組，每組3平行。各孔鏡片在34℃孵育24 h后（溶液2），放入另一孔含等量PBS中漂洗一遍（溶液3）；再分別置于含有2 mL RCLS或MeniconProgent的新孔中，室溫下浸泡30 min（溶液4），對(duì)照組以PBS代替；作用30 min后，每組鏡片再依次用PBS漂洗2遍（溶液5）。BCA法分別測(cè)定溶液1、2、3、4、5中溶菌酶的含量［6］。計(jì)算鏡片吸附蛋白量：A=B-C-D（A：鏡片吸附溶菌酶的量；B：溶液1溶菌酶的量；C：溶液2溶菌酶的量；D：溶液3溶菌酶的量）；計(jì)算兩組護(hù)理液洗脫蛋白量：E=F+G（E：洗脫蛋白量；F：溶液4溶菌酶的量；G：溶液5溶菌酶的量）；計(jì)算兩組護(hù)理液的除蛋白率：H=E/A×100％。

1.2.4 兔眼刺激實(shí)驗(yàn)［7-8］實(shí)驗(yàn)前1 d用1％熒光素鈉染色、裂隙燈檢查兔眼，選擇無任何眼病變及炎癥的健康新西蘭白兔6只。每只兔左眼下結(jié)膜囊內(nèi)分別滴入0.1 mL RCLS或MeniconProgent，被動(dòng)閉眼2 s。同法右眼作為對(duì)照眼，滴入等量生理鹽水。分別在滴眼后1 h、24 h、48 h和72 h裂隙燈檢查角膜、虹膜、結(jié)膜情況，拍照記錄，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.10-2005眼損傷記分系統(tǒng)記分［9］。

1.2.5 兔皮膚刺激實(shí)驗(yàn)［10-13］新西蘭大白兔6只，實(shí)驗(yàn)前一天將背脊兩側(cè)的毛用剃須刀剃去，約10 cm× 15 cm大小區(qū)域。取2.5 cm×2.5 cm大小的兩層紗布?jí)K若干，每塊紗布?jí)K滴加0.5 mL樣品溶液浸濕，陽性對(duì)照物為質(zhì)量分?jǐn)?shù)1％2，4-二硝基氯苯（CDNB）的丙酮-橄欖油溶液（丙酮∶橄欖油=1∶1），陰性對(duì)照為等量的生理鹽水溶液；將紗布?jí)K貼敷于兔子裸露皮膚處，紗布?jí)K上覆蓋一層保鮮膜、兩層干紗布，最后以醫(yī)用透明敷料固定，敷用時(shí)間6 h。連續(xù)敷5 d，在除去受試物后1 h、24 h、48 h、72 h觀察皮膚反應(yīng)。按照GB/T 16886.10-2005皮膚反應(yīng)記分系統(tǒng)記分，根據(jù)刺激反應(yīng)類型評(píng)價(jià)刺激強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 短期作用HCE-2細(xì)胞（15 min～1 h），RCLS組細(xì)胞均存活86.067％，細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組無異，呈梭形和三角形（圖1）；作用2 h，細(xì)胞存活51.125％，因營(yíng)養(yǎng)耗竭，細(xì)胞由伸展?fàn)顟B(tài)逐漸回縮變圓；作用時(shí)間延長(zhǎng)至24 h時(shí)，細(xì)胞存活率逐漸降低，大部分都收縮變圓，但仍有11.685％存活。而MeniconProgent在作用初始15min即對(duì)細(xì)胞有腐蝕作用，使細(xì)胞解離成碎片，對(duì)細(xì)胞毒性極大。兩組護(hù)理液作用不同時(shí)間細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組作用HCE-2細(xì)胞450 nm吸光度值（OD）及細(xì)胞存活率（±s，n=5）

表1 不同實(shí)驗(yàn)組作用HCE-2細(xì)胞450 nm吸光度值（OD）及細(xì)胞存活率（±s，n=5）

作用時(shí)間吸光度值細(xì)胞存活率（％）MeniconProgent RCLS MeniconProgent RCLS 15 min 0.188±0.003 0.253±0.004 0.000 86.067 1 h 0.176±0.005 0.245±0.004 0.000 83.211 2 h 0.181±0.001 0.234±0.006 0.000 51.125 4 h 0.190±0.001 0.216±0.001 0.000 18.548 8 h 0.203±0.003 0.224±0.011 0.000 16.078 24 h 0.159±0.001 0.180±0.003 0.400 11.685

圖1.護(hù)理液作用不同時(shí)間HCE-2細(xì)胞的形態(tài)變化

2.2 除蛋白功效比較 RCLS與MeniconProgent同時(shí)浸泡鏡片30 min，對(duì)鏡片吸附蛋白的除去率，前者為83.159％，后者為85.180％，兩組護(hù)理液除蛋白功效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.81，P＞0.05）。

2.3 兔眼刺激實(shí)驗(yàn) 給藥前及停藥后1 h、24 h、48 h、72 h用裂隙燈檢查兔眼，觀察眼結(jié)膜、角膜、虹膜和其他部位的損傷情況，將每一觀察時(shí)間點(diǎn)及每一動(dòng)物的眼結(jié)膜、虹膜和結(jié)膜的刺激反應(yīng)分值相加得總積分，將每組的總積分除以動(dòng)物總數(shù)，既得刺激積分。停藥后，與生理鹽水對(duì)照組相比，RCLS組兔眼在任何階段均未出現(xiàn)眼瞼水腫、分泌物增加等刺激性反應(yīng)，眼部刺激積分均為0（表2）；MeniconProgent組滴眼后1 h，兔眼結(jié)膜彌散性充血且明顯水腫，眼內(nèi)分泌物明顯增多，浸濕眼瞼及睫毛（圖2）；熒光素鈉染色后角膜有斑點(diǎn)狀染色區(qū)域。給藥后24 h均恢復(fù)正常。

2.4 兔皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 連續(xù)5次敷貼給藥后，CDNB陽性對(duì)照組皮膚在各觀察期內(nèi)均有紅斑、水腫且結(jié)痂的現(xiàn)象，敷貼期間兔子伴有疼痛、抓撓表現(xiàn)。RCLS組和生理鹽水對(duì)照組在敷貼期間兔子均無異常表現(xiàn)，其中，RCLS組皮膚出現(xiàn)極輕微紅斑，隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，紅斑逐漸消失；MeniconProgent組皮膚有明顯紅斑、輕微水腫。根據(jù)刺激評(píng)分，RCLS組各時(shí)間點(diǎn)刺激積分均小于0.5（表3），與陰性對(duì)照生理鹽水組一樣屬于無刺激物，MeniconProgent對(duì)皮膚有輕度刺激，CDNB陽性對(duì)照則對(duì)皮膚有重度刺激。

表2 兔眼刺激實(shí)驗(yàn)評(píng)分表（±s，n=3）

表2 兔眼刺激實(shí)驗(yàn)評(píng)分表（±s，n=3）

組別給藥前1 h 72 h生理鹽水對(duì)照組停藥后1 h停藥后24 h停藥后48 h停藥后0 0 0 0 0 RCLS組0 0 0 0 0 MeniconProgent組0 3.670±0.577 0 0 0

圖2.眼刺激1h后兔眼表現(xiàn)

表3 兔皮膚多次刺激評(píng)分表±s，n=6）

表3 兔皮膚多次刺激評(píng)分表±s，n=6）

組別停藥后1 h停藥后24 h停藥后48 h停藥后72 h生理鹽水對(duì)照組0000 RCLS組0.417±0.500 0.167±0.577 0.167±0.577 0.083±0.500 MeniconProgent組1.667±0.000 1.334±0.577 0.667±0.000 0.166±0.577 CDNB陽性對(duì)照組7.067±0.548 6.267±0.894 5.467±0.447 5.433±0.548

3 討論

RCLS的主要除蛋白成分為三氟乙酸，是一種強(qiáng)酸。早在1990年有人用其與乙腈的混合溶液萃取軟鏡鏡片上吸附的蛋白，章瑾等［6］也對(duì)其最佳的除蛋白濃度做了研究。MeniconProgent為一種強(qiáng)效清潔、除蛋白護(hù)理液，主要成分A液為NaCLO，B液為KBr，兩者混合后pH值約為10.5。其除蛋白原理為A、B液反應(yīng)后生成的NaOH、次氯酸和溴單質(zhì)，NaOH發(fā)揮除蛋白作用，次氯酸發(fā)揮漂洗作用。本文將功能類似的2種護(hù)理液RCLS和MeniconProgent的除蛋白效果作比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RCLS的除蛋白效率為83.159％，MeniconProgent為85.182％，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

影響護(hù)理液生物相容性的因素有很多，pH值、滲透壓的變化、不同的化學(xué)成分均能帶來不同的影響。本院在研制RCLS時(shí)充分考慮了溶液的酸堿度，其pH值也完全在眼睛耐受范圍之內(nèi)。為了研究護(hù)理液的化學(xué)成分在人眼內(nèi)的相容性，分析護(hù)理液的滯留對(duì)人角膜細(xì)胞的影響，本文也研究了RCLS與MeniconProgent對(duì)人眼角膜上皮細(xì)胞的毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeniconProgent對(duì)細(xì)胞作用15 min即能將細(xì)胞全部溶解，細(xì)胞毒性極大，不能直接接觸人眼。RCLS作用細(xì)胞短期內(nèi)（＜1 h）細(xì)胞存活率均大于80％，細(xì)胞形態(tài)正常；作用2 h，細(xì)胞約有一半形態(tài)皺縮變圓，細(xì)胞間隙變大；持續(xù)作用時(shí)間延長(zhǎng)至24 h時(shí)，因營(yíng)養(yǎng)的耗竭，細(xì)胞的毒性也繼續(xù)加大。由此說明，相對(duì)于MeniconProgent而言，RCLS的細(xì)胞相容性更優(yōu)，如不慎入眼，短期內(nèi)（＜1 h）對(duì)角膜細(xì)胞沒有大的損傷，但是也不能作為滴眼劑經(jīng)常入眼。通常情況下，硬鏡在經(jīng)過除蛋白護(hù)理液護(hù)理后要用更加溫和無刺激的全功能護(hù)理液沖洗才能佩戴。

藥物對(duì)眼刺激實(shí)驗(yàn)表明：RCLS對(duì)兔眼角膜、虹膜、結(jié)膜等均無刺激性，各組平均記分為0。相比RCLS，MeniconProgent滴眼后1 h兔眼結(jié)膜彌散性充血且明顯水腫，眼內(nèi)分泌物明顯增多，浸濕眼瞼及睫毛，熒光素鈉染色后角膜有點(diǎn)狀彌漫性染色區(qū)域，說明MeniconProgent對(duì)兔眼有刺激性。兔的多次皮膚給藥刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RCLS對(duì)兔皮膚刺激積分＜0.5，與生理鹽水一樣屬于無刺激物；而同類產(chǎn)品MeniconProgent給藥后1 h，兔皮膚出現(xiàn)明顯紅斑，對(duì)皮膚有輕度刺激。

綜上所述：在除蛋白型硬鏡護(hù)理液產(chǎn)品中，護(hù)理液RCLS與現(xiàn)有市售產(chǎn)品MeniconProgent通過BCA法測(cè)得的除蛋白效果無異，其對(duì)角膜上皮細(xì)胞毒性，眼內(nèi)、皮膚刺激性更小。但是，也應(yīng)指出的是，本研究中的測(cè)定浸泡過吸附有溶菌酶鏡片的護(hù)理液蛋白含量，為間接反映護(hù)理液的除蛋白效果，尚需結(jié)合直接測(cè)定方法比較除蛋白效果，這也是我們下一步的工作。RCLS目前仍處于臨床前研究階段，為了全面評(píng)價(jià)其功能，也需要多種指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，本文的研究也為后續(xù)的清潔、消毒、鏡片相容性等研究奠定了基礎(chǔ)。

（本文作者與研究產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷售廠商無任何經(jīng)濟(jì)利益關(guān)系）

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Deproteinization efficacy and biocompatibility between a new rigid contact lens care solution and MeniconProgent

WENGYu-hua，LI Ling-li，LUO Li＊，NAN Kai-hui，JINWan-qing，CHEN Yun-yun.Institute of Biomedical Engineering，Eye Hospital ofWenzhou Medical College，Wenzhou 325027，China

NAN Kai-hui，Email：nankh＠163.com

ObjectiveTo evaluate the biocompatibility of a new type of rigid contact lens care solution（RCLS）including deproteinization effect，cytotoxicity on human corneal epithelium cells，irritation of eyes and skin，compared with MeniconProgent，a commercially available contact lens care solution.Methods The human corneal epithelial cells HCE-2 were planted in 96-well plates，co-cultured with RCLS，MeniconProgent and cell medium respectively.Cell viability was determined usingWST-1 reagent to detect the absorbance ofeach well after exposure for different time at450 nm；For deproteinization efficacy experiment，two groups of rigid contact lenswere soaked in 2mg/mL lysozyme solution for 24 hours，then immersed in RCLSor MeniconProgent for30min.The protein contentof each solution was determined with BCA kit；The New Zealand white rabbits were chosen to take irritant experiment.Each rabbit had one drop testing solution in one eye.The resultwas recorded after experiment.The gauze pieceswas steeped with RCLSorMeniconProgent before fixing them onto the skin of rabbits′back，and the injury of the skin was evaluated.Results The RCLS had a 83.159％deproteinization rate of lysozyme adsorbed upon the surface of lens，comparing to MeniconProgent of85.180％，which had no significant difference.Cytotoxicity results showed thatMeniconProgentmight lead to cell lysiswhich reveals a severe toxicity on corneal epithelium cells，and italso has irritating effect to eyes and skin.When co-cultured in RCLS for an hour，the toxicity of RCLSwas less than 20％，neither irritating to the rabbiteyes nor to the skin.Conclusions RCLShad a superior biocompatibility comparing to MeniconProgent in regard to cytotoxicity and irratanting.（Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：100-104）

Rigid contact lens；Caresolution；Deproteinization efficacy；Biocompatibility

2012-09-20）

（本文編輯 諸靜英）

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2012DFB30020）；浙江省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2009R50039，2011R09039-13）；

浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目（2010）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20100339）

溫州醫(yī)學(xué)院眼視光學(xué)院醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)工程研究院 溫州 325027；＊愛爾康（中國(guó)）眼科產(chǎn)品有限公司 北京 100016

南開輝（Email：nankh＠163.com）