上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物對(duì)鼻咽癌遠(yuǎn)期療效預(yù)測(cè)的意義

李驥 王勝資 王紓宜 鄒麗芬

鼻咽癌具有高度局部浸潤性和早期頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向，60%～85%的患者在初診時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［1］。臨床上有40%的患者存在無癥狀的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，90%死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前，國內(nèi)外就上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與鼻咽癌的研究報(bào)道大多數(shù)停留在近期療效的觀察上，針對(duì)遠(yuǎn)期療效關(guān)系的報(bào)道至今不多，其相關(guān)標(biāo)志物能否提示鼻咽癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后尚未得到證實(shí)。上皮鈣粘連素(E-Cadherin)、神經(jīng)鈣粘連素(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和Twist作為EMT的分子標(biāo)志物，與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移、侵襲關(guān)系密切［2-4］。本研究旨在探討EMT相關(guān)標(biāo)志物與鼻咽癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為進(jìn)一步研究是否能在治療前預(yù)測(cè)鼻咽癌患者遠(yuǎn)期療效，為臨床綜合治療鼻咽癌提供新的思路，使整個(gè)治療計(jì)劃更具有針對(duì)性。

1 資料與方法

1.1 資料 收集本院放療科2005年10月～2006年1月治療的、病理組織學(xué)確診為鼻咽低分化鱗狀細(xì)胞癌患者77例，其中男性54例、女性23例，男女比例為2.35∶1;年齡13～76歲，中位年齡51歲。所有患者心、肺、肝及腎功能基本正常;行為狀態(tài)(karnofsky performance status，KPS)評(píng)分均＞80分。所有患者采用2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)鼻咽癌TNM分期法，T1～T2期47例、T3～T4期30例;N0期20例、N1～N3期57例;Ⅰ～Ⅱ期33例、Ⅲ～Ⅳ期44例。頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷根據(jù)CT掃描結(jié)果:①淋巴結(jié)腫大直徑＞1 cm;②成簇狀的淋巴結(jié);③淋巴結(jié)周圍的脂肪間隙消失及鄰近筋膜增厚;④腫大淋巴結(jié)侵及鄰近組織或結(jié)構(gòu);⑤淋巴結(jié)中心有壞死。所有患者在施行放射治療(簡(jiǎn)稱放療)前均接受胸部正側(cè)位X線片、鼻咽鏡、頭頸部CT或磁共振成像掃描、腹部B超、全身骨掃描以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查，明確分期和除外遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。采用2300CD直線加速器(VARIAN公司)6MV-X線常規(guī)分次放療，鼻咽部劑量70～74 Gy，頸部劑量50～60 Gy。收集上述77例患者的組織標(biāo)本，患者之前均未接受放化療及其他輔助治療，取得患者和家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 ① 兔抗人E-Cadherin單克隆抗體(克隆號(hào)EP700Y)，兔抗人N-Cadherin單克隆抗體(克隆號(hào) EPR1792Y)，兔抗人Twist多克隆抗體(克隆號(hào)ab50581)，兔抗人Vimentin單克隆抗體(克隆號(hào) SP20)，均購自美國Epitomics公司。②UltraSensitiveTM超敏鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組織化學(xué)染色超敏試劑盒，購自美國Maxim Biotech公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 新鮮組織標(biāo)本常規(guī)4% 甲醛固定，石蠟包埋。免疫組織化學(xué)染色4 μm厚石蠟切片，選用EnVision兩步法(Dako公司)，染色參照產(chǎn)品說明書。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)陽性結(jié)果標(biāo)準(zhǔn) E-Cadherin和N-Cadherin以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒為陽性表達(dá);Twist陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)，部分細(xì)胞核也有著色，呈棕黃色或深褐色;Vimentin以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用免疫組織化學(xué)陽性指數(shù)［5］進(jìn)行免疫組織化學(xué)半定量分析。采用MIQAS醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)和醫(yī)學(xué)圖像定量分析軟件，測(cè)量免疫組織化學(xué)圖像中陽性區(qū)域面積和陽性比率以及光密度值(optical density，OD)，每張切片分析3個(gè)視野;免疫組織化學(xué)陽性指數(shù)等于陽性面積與OD值的乘積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平定為P＜0.05。單因素分析數(shù)值變量用t檢驗(yàn)，分類變量用卡方檢驗(yàn)或精確概率法，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行Logistic多因素回歸分析。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

77例鼻咽癌患者中位隨訪49個(gè)月(1～61個(gè)月)(自患者入組治療至2010年11月為隨訪時(shí)間;若患者在此期間出現(xiàn)截尾事件如復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡或失訪，則隨訪時(shí)間為自患者入組治療至截尾時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間)，15例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，其中腫瘤復(fù)發(fā)6例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1例、肝轉(zhuǎn)移3例、肺轉(zhuǎn)移3例、骨轉(zhuǎn)移1例、肝轉(zhuǎn)移合并骨轉(zhuǎn)移(均經(jīng)細(xì)胞學(xué)穿刺或影像學(xué)檢查證實(shí))1例。隨訪期間共有8例患者死亡，7例死于腫瘤轉(zhuǎn)移，另1例死于腦梗死。

2.1 E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 和 Twist蛋白表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)之間的關(guān)系 采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了77例鼻咽癌患者的癌組織內(nèi)E-Cadherin、N-Cadherin，Vimentin和Twist的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E-Cadherin蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃或棕褐色，陽性細(xì)胞彌漫或局灶性分布(圖1);N-Cadherin蛋白主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，呈棕黃色至深褐色彌散性分布(圖2);Vimentin蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，呈棕黃色顆粒(圖3);Twist蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，部分胞核也有著色，呈棕黃色至深褐色彌散性分布(圖4)。

圖1.E-Cadherin在鼻咽癌中低表達(dá)(A)和高表達(dá)(B)(SP×200)

圖2.N-Cadherin在鼻咽癌中低表達(dá)(A)和高表達(dá)(B)(SP×200)

圖3.Vimentin在鼻咽癌中低表達(dá)(A)和高表達(dá)(B)(SP×200)

圖4.Twist在鼻咽癌中低表達(dá)(A)和高表達(dá)(B)(SP×200)

根據(jù)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的情況分為鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移組(15例)和鼻咽癌無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移組(62例)。經(jīng)單因素分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 和Twist蛋白表達(dá)與鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)(表1)。將腫瘤 E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 和 Twist列入多因素分析，發(fā)現(xiàn)E-Cadherin和Vimentin是影響鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(表2)。

表1 77例鼻咽癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的單因素分析

表2 77例鼻咽癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的多因素分析

2.2 E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 和 Twist蛋白與鼻咽癌的預(yù)后關(guān)系 分別以E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Twist的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，高于中位數(shù)為高表達(dá)組，低于中位數(shù)為低表達(dá)組。77例鼻咽癌中，E-Cadherin高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的5年累積生存率分別為96.7%及80%;N-Cadherin高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的5年累積生存率分別為82%及96.6%;Vimentin高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的5年累積生存率分別為83%及95.8%;Twist高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的5年累積生存率分別為82.1%及96.3%。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析并作生存曲線，經(jīng)Logrank檢驗(yàn)顯示腫瘤組織內(nèi)E-Cadherin低表達(dá)與高表達(dá)患者間生存率有顯著差異(P=0.017)，N-Cadherin高表達(dá)與低表達(dá)患者間生存率有顯著差異(P=0.033)，Twist高表達(dá)與低表達(dá)患者間生存率也有顯著差異(P=0.036)，而Vimentin高表達(dá)與低表達(dá)患者間生存率無顯著差異(P=0.055)(圖5～8)。

圖5.鼻咽癌組織內(nèi)E-Cadherin表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

圖6.鼻咽癌組織內(nèi)N-Cadherin與患者生存率的關(guān)系

圖7.鼻咽癌組織內(nèi)Vimentin與患者生存率的關(guān)系

3 討論

圖8.鼻咽癌組織內(nèi)Twist與患者生存率的關(guān)系

惡性腫瘤治療失敗的主要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近年來關(guān)于腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究表明，EMT現(xiàn)象與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲和預(yù)后的關(guān)系密切［6-7］。盡管實(shí)驗(yàn)研究表明E-Cadherin和Twist與鼻咽癌關(guān)系密切，但是EMT標(biāo)志物與鼻咽癌的遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系報(bào)道不多。我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)鼻咽癌組織中E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 和 Twist的表達(dá)情況，分析EMT相關(guān)標(biāo)志物對(duì)鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值，為鼻咽癌的綜合治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

E-Cadherin向N-Cadherin轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是EMT現(xiàn)象的標(biāo)志，E-Cadherin介導(dǎo)上皮細(xì)胞間黏附，而N-Cadherin促進(jìn)細(xì)胞遷移［8-9］。上皮性腫瘤細(xì)胞中N-Cadherin陽性表達(dá)，可能提示癌細(xì)胞更容易獲得運(yùn)動(dòng)和浸潤的能力，甚至可以克服E-Cadherin抑制腫瘤發(fā)展的作用［10］。E-Cadherin是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，而E-Cadherin基因的去甲基化是鼻咽癌治療的一種新的潛在策略［11］。既往研究［12-13］表明，E-Cadherin下調(diào)和N-Cadherin上調(diào)在許多上皮性腫瘤中常見，且與這些腫瘤的臨床病理分期、浸潤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時(shí)對(duì)這些腫瘤的預(yù)后有預(yù)測(cè)價(jià)值。E-Cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)在鼻咽癌中已有證實(shí)，且發(fā)現(xiàn)其在鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要角色［3，14］。我們的單因素分析結(jié)果顯示，鼻咽癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與E-Cadherin下調(diào)和N-Cadherin上調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在鼻咽癌中也存在著E-Cadherin向N-Cadherin轉(zhuǎn)化的可能性。通過多因素分析，我們發(fā)現(xiàn)僅E-Cadherin與鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，盡管N-cadherin在多因素分析中未發(fā)現(xiàn)與鼻咽癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，其仍然在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用［15-16］。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，E-Cadherin下調(diào)和N-Cadherin上調(diào)提示鼻咽癌患者生存期短，預(yù)后差。因此，E-Cadherin和N-Cadherin對(duì)鼻咽癌的遠(yuǎn)期療效具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，兩者聯(lián)合檢測(cè)有可能將預(yù)后較差的患者在治療前就篩選出來，使之能得到及時(shí)的個(gè)體化治療，使其綜合治療的方案更具針對(duì)性，從而提高遠(yuǎn)期療效。

Vimentin是EMT的特征性標(biāo)志物。日本學(xué)者證實(shí)在EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1基因轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞中存在Vimentin上調(diào)，提示EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1在鼻咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移中有一定作用［17］。本研究通過單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中Vimentin高表達(dá)的患者易發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，鼻咽癌組織中Vimentin低表達(dá)者預(yù)后較好。因此，Vimentin有可能成為鼻咽癌遠(yuǎn)期療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

E-cadherin丟失是 EMT的關(guān)鍵，而 Twist介導(dǎo)E-Cadherin的丟失。Twist是調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，在腫瘤形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用［18-19］。Horikawa 等［20］研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌中，Twist和EMT是由EB病毒潛伏膜蛋白1誘導(dǎo)的，Twist表達(dá)與該蛋白具有直接相關(guān)性，且Twist表達(dá)與鼻咽癌的臨床轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。另外，作者運(yùn)用免疫組織化學(xué)法分析了75例鼻咽癌組織，其中有33例Twist蛋白陽性。Twist mRNA和蛋白與鼻咽癌的淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且與預(yù)后有密切聯(lián)系，Twist蛋白陽性者5年生存率較差。上述結(jié)果提示，Twist在鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，是評(píng)估鼻咽癌預(yù)后的有用指標(biāo)，Twist蛋白有望成為新的鼻咽癌治療靶點(diǎn)。我們通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)Twist蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，盡管多因素分析未發(fā)現(xiàn)Twist對(duì)鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有顯著意義，但單因素分析證實(shí)Twist高表達(dá)與鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。另外，Twist蛋白對(duì)預(yù)測(cè)鼻咽癌患者預(yù)后有一定價(jià)值，其高表達(dá)的患者生存期較低表達(dá)者明顯降低，上述結(jié)果表明Twist蛋白可能是鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，本研究認(rèn)為鼻咽癌組織中存在EMT現(xiàn)象，可能存在 E-Cadherin向 N-Cadherin轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。E-Cadherin下調(diào)，N-Cadherin、Vimentin 和 Twist上調(diào)提示鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛能高，患者預(yù)后差;相反，E-Cadherin上調(diào)，N-Cadherin、Vimentin 和 Twist下調(diào)提示鼻咽癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移潛能相對(duì)較低，患者預(yù)后較好。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和 Twist作為 EMT 標(biāo)志物，對(duì)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)作用，可以作為今后鼻咽癌遠(yuǎn)期療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

［1］吳秉銓，方偉崗.腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及其阻斷——癌擴(kuò)散的基礎(chǔ)和臨床［M］.杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社，2005:1-119.

［2］Guo D，Xu BL，Zhang XH，et al.Cancer stem-like side population cells in the human nasopharyngeal carcinoma cell line cne-2 possess epithelial mesenchymal transition properties in association with metastasis［J］.Oncol Rep，2012，28(1):241-247.

［3］Yip WK，Seow HF.Activation of phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signalingby EGF downregulatesmembranousE-cadherin and β-catenin and enhances invasion in nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Cancer Lett，2012，318(2):162-172.

［4］Luo WR，Chen XY，Li SY，et al.Neoplastic spindle cells in nasopharyngeal carcinoma show features of epithelial-mesenchymal transition［J］.Histopathology，2012，61(1):113-122.

［5］Xu B，Sun Y，Tang G，et al.Id-1 expression in androgen-dependent prostate cancer is negatively regulated by androgen through androgen receptor［J］.Cancer Lett，2009，278(2):220-229.

［6］徐娟，唐敏，曹亞.上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2008，28(6):504-507.

［7］Muramaki M，Miyake H，Terakawa T，et al.Expression profile of E-cadherin and N-cadherin in non-muscle-invasive bladder cancer as a novel predictor of intravesical recurrence following transurethral resection［J］.Urol Oncol，2012 ，30(2):161-166.

［8］Rosivatz E，Becker I，Bamba M，et al.Neoexpression of N-cadherin in E-cadherin positive colon cancers［J］.Int J Cancer，2004 ，111(5):711-719.

［9］Otsuki S，Inokuchi M，Enjoji M，et al.Vimentin expression is associated with decreased survival in gastric cancer［J］.Oncol Rep，2011，25(5):1235-1242.

［10］Batlle E，Sancho E，F(xiàn)rancí C，et al.The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells［J］.Nat Cell Biol，2000，2(2):84-89.

［11］Ran Y，Wu S，You Y.Demethylation of E-cadherin gene in nasopharyngeal carcinoma could serve as a potential therapeutic strategy［J］.J Biochem，2011，149(1):49-54.

［12］Muramaki M，Miyake H，Terakawa T，et al.Expression profile of E-cadherin and N-cadherin in non-muscle-invasive bladder cancer as a novel predictor of intravesical recurrence following transurethral resection［J］.Urol Oncol，2012，30(2):161-166.

［13］Bryan RT，Tselepis C.Cadherin switching and bladder cancer［J］.J Urol，2010，184(2):423-431.

［14］Galera-Ruiz H，Ríos MJ，González-Cámpora R，et al.The cadherincatenin complex in nasopharyngeal carcinoma［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2011，268(9):1335-1341.

［15］Nguyen PT，Kudo Y，Yoshida M，et al.N-cadherin expression is correlated with metastasis of spindle cell carcinoma of head and neck region［J］.J Oral Pathol Med，2011，40(1):77-82.

［16］Nguyen PT，Kudo Y，Yoshida M，et al.N-cadherin expression is involved in malignant behavior of head and neck cancer in relation to epithelial-mesenchymal transition［J］.Histol Histopathol，2011，26(2):147-156.

［17］Saito S，Kusano S，Koizuka I，et al.The up-regulation of vimentin and ezrin in the Epstein-Barr virus LMP1 gene transfected cells［J］.Nippon Jibiinkoka Gakkai Kaiho，2007，110(1):24-31.

［18］?o?ic'D，Richardson JA，Yu K，et al.Twist regulates cytokine gene expression through a negative feedback loop that represses NF-kappaB activity［J］.Cell，2003，112(2):169-180.

［19］Fondrevelle ME，Kantelip B，Reiter RE，et al.The expression of Twist has an impact on survival in human bladder cancer and is influenced by the smoking status［J］.Urol Oncol，2009，27(3):268-276.

［20］Horikawa T，Yang J，Kondo S，et al.Twist and epithelial-mesenchymal transition are induced by the EBV oncoprotein latent membrane protein 1 and are associated with metastatic nasopharyngeal carcinoma［J］.Cancer Res，2007，67(5):1970-1978.