MMPs激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2以及Ⅰ型膠原表達(dá)的作用研究△

鄒蕾蕾 劉睿 劉紅 黃莉雯 周行 濤周浩

·基礎(chǔ)研究·

MMPs激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2以及Ⅰ型膠原表達(dá)的作用研究△

鄒蕾蕾 劉睿 劉紅 黃莉雯 周行 濤周浩

目的研究基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族MMP-1、MMP-2激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)人鞏膜Ⅰ型膠原表達(dá)的作用，探討MMP-1和MMP-2在人鞏膜膠原代謝中的作用。方法應(yīng)用人鞏膜成纖維細(xì)胞系作為研究模型，用熒光定量檢測(cè)MMPs激動(dòng)劑醋酸氨基苯汞（APMA）及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1和MMP-2活性的影響；實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)以及免疫印跡蛋白定量法檢測(cè)比較激動(dòng)劑組與抑制劑組對(duì)MMP-1/2以及Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)的變化；最后用siRNA干擾敲除MMP-1、MMP-2或MMP-1/2后，檢測(cè)鞏膜成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白水平的變化。結(jié)果MMPs激動(dòng)劑引起MMP-1/2活性顯著增加，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)下降，MMPs抑制劑引起MMP-1/2活性顯著下降，相應(yīng)的Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)增加（均P＜0.01）。激動(dòng)劑可引起MMP-1 mRNA表達(dá)增加（P＜0.01），對(duì)MMP-2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響（P＞0.05），而抑制劑能引起MMP-2 mRNA表達(dá)下降（P＜0.01），但對(duì)MMP-1 mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。應(yīng)用siRNA干擾方法敲除MMP-1、MMP-2或兩者同時(shí)被敲除后，MMP-1蛋白表達(dá)均顯著降低（均P＜0.01），MMP-2除在MMP-1 siRNA干擾敲除組無(wú)明顯變化外（P＞0.05），其余各組均顯著下降（均P＜0.01）；Ⅰ型膠原的表達(dá)在各敲除組中顯著增加，當(dāng)MMP-1和MMP-2均干擾敲除時(shí)，Ⅰ型膠原的表達(dá)增加最為顯著（均P＜0.01）。結(jié)論在人鞏膜成纖維細(xì)胞系中，MMP-1/2激動(dòng)劑和抑制劑均能引起MMP-1/2活性改變及相應(yīng)的MMP-1/2蛋白表達(dá)變化，并最終導(dǎo)致Ⅰ型膠原表達(dá)的變化；MMP-1和MMP-2是調(diào)控人鞏膜Ⅰ型膠原重塑的關(guān)鍵因子。（中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2013，13：91-95）

人鞏膜成纖維細(xì)胞；基質(zhì)金屬蛋白酶1；基質(zhì)金屬蛋白酶2；膠原，Ⅰ型

近視是由于眼軸異常延長(zhǎng)所致。因此，明確近視眼眼軸延長(zhǎng)的機(jī)制，是控制近視發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。大量研究［1-4］提示，鞏膜的細(xì)胞外基質(zhì)重塑以及生物力學(xué)方面的變化，可能導(dǎo)致眼軸增長(zhǎng)，近視形成?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一系列能降解多種大分子物質(zhì)的酶，幾乎能夠降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）成分。目前研究［5-6］發(fā)現(xiàn)鞏膜I型膠原改變與MMPs密切相關(guān)，其中MMP-1、MMP-2均可以降解Ⅰ型和Ⅱ型膠原。已發(fā)現(xiàn)人鞏膜成纖維細(xì)胞上有MMP-1和MMP-2表達(dá)，然而尚無(wú)體外實(shí)驗(yàn)證明MMP-1、MMP-2激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMPs及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響，因此本研究用人鞏膜成纖維細(xì)胞系來(lái)研究MMP-1、MMP-2對(duì)Ⅰ型膠原的作用，應(yīng)用siRNA干擾方法敲除MMP-1或MMP-2后，檢測(cè)鞏膜成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA和蛋白水平的變化，從而明確探討MMP-1、MMP-2是否是引起人鞏膜I型膠原降解的關(guān)鍵因子，為今后進(jìn)一步闡明MMP-1和MMP-2在近視眼眼軸延長(zhǎng)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人鞏膜成纖維細(xì)胞系（中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）、β-actin（Santa Cruz公司，美國(guó)）、無(wú)水乙醇（溶于DEPC處理的水中）、Trizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）、三蒸水（無(wú)RNA酶水）、羊抗兔IgG-HRP試劑盒（北京博奧森生物）、顯影液（KODA公司，美國(guó)）、定影液（KODA公司，美國(guó)）、ECL發(fā)光試劑盒A、B液（武漢博士得公司）、MMP-1抑制劑Z-Pro-Leu-Gly-NHOH（ENZO公司，美國(guó)）、MMP-2抑制劑ARP-101（SIGMA-ALDRICH公司，美國(guó)）及MMPs激動(dòng)劑（SIGMA公司，美國(guó)）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測(cè)激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)MMP-1/2活性的影響

（1）用熒光定量法檢測(cè)MMPs激動(dòng)劑醋酸氨基苯汞（P-aminophenylmercuric acetate，APMA）及MMP-1抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1活性的影響：將人鞏膜成纖維細(xì)胞種在6孔培養(yǎng)板中，等細(xì)胞密度達(dá)到80％后，加入APMA（1 mmol/L）處理細(xì)胞2 h或Z-Pro-Leu-Gly-NHOH處理細(xì)胞18 h，裂解細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定MMP-1的活性。

（2）采用酶譜法檢測(cè)APMA及MMP-2抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-2活性的影響：將人鞏膜成纖維細(xì)胞種在6孔培養(yǎng)板中，等細(xì)胞密度達(dá)到80％，加入APMA（1 mmol/L）處理細(xì)胞18 h或ARP-101處理細(xì)胞18 h，裂解細(xì)胞，按前述酶譜法測(cè)定MMP-2的活性。

1.2.2 測(cè)量MMP-1/2mRNA以及I型膠原mRNA的表達(dá)

（1）目的基因引物的合成：引物由上海基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心合成。引物序列如下：β-actin的擴(kuò)增大小148 bp，上游引物：5′GCACCCAGCCAATATAGGAC3′，下游引物：5′AGAATTGTCCCTTGGCCTCT3′；MMP-1擴(kuò)增大小為354 bp，上游引物：5′AGGTTATCCCAAAATGA TAG3′，下游引物：5′TGCAGTTGAACCAGCTATTA3′；MMP-2擴(kuò)增大小為90 bp，上游引物：5′TACAGG ATCATTGGCTACACACC3′，下游引物：5′GGTCACA TCGCTCCAGACT3′；膠原I擴(kuò)增大小為125 bp，上游引物：5′GCACCTCTCACTCCATTACA3′，下游引物：5′AAATGAAAGTCAAGGGGAAC3′。

（2）Trizol法提取細(xì)胞總mRNA，RT試劑盒對(duì)總mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time reverse transcriptional polymerase chain reaction，RTPCR）：PCR反應(yīng)液中，cDNA 0.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SYBS green supermix 12.5 μL，去離子水6μL。把配制好的PCR反應(yīng)液20μL置入200μL的滅菌離心管，迅速放入FeroTec Gradien PCR擴(kuò)增儀，按擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

（4）將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣本各取1μL，在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測(cè)熒光強(qiáng)度，自動(dòng)繪制動(dòng)力學(xué)曲線，判讀其Ct值。采用比較閾值法計(jì)算待測(cè)樣本中目的基因表達(dá)相對(duì)于校正樣本的變化倍數(shù)。

1.2.3 檢測(cè)MMP-1/2以及I型膠原蛋白的表達(dá) 免疫印跡蛋白定量（Western-blot）方法檢測(cè)：收集細(xì)胞，用冷磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌3次后，將細(xì)胞重懸于細(xì)胞裂解液中，冰浴6 min，使細(xì)胞充分裂解離心，收集上清液，分裝凍存配置BCA工作液；分別吸25μL標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)樣品至微孔板對(duì)應(yīng)孔中，每孔加入200μL BCA工作液，震蕩6 s以徹底混合均勻。蓋好微孔板，7℃孵育6 min，冷卻至室溫。測(cè)量各孔590 nm吸光度值，測(cè)得的每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔的吸光度值分別減去空白孔平均吸光度值。以校正過(guò)的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白測(cè)量值對(duì)其濃度（mg/L）做圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量待測(cè)樣品蛋白濃度，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳完畢后對(duì)凝膠進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢取出PVDF膜，置于含50 mg/L脫脂奶粉的TTBS封閉液中，于室溫封閉2 h與一抗結(jié)合，洗膜。二抗結(jié)合，抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，信號(hào)強(qiáng)度用Bio 1D圖像分析軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.4 siRNA干擾 在人鞏膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染合成的MMP-1 siRNA或MMP-2 siRNA以及對(duì)照siRNA，轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，用免疫印跡蛋白定量檢測(cè)MMP-1、MMP-2蛋白水平的變化，確證siRNA干擾的效果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。凡對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間差異分別行配對(duì)t檢驗(yàn)，組間差異行完全隨機(jī)單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。方差不齊時(shí)，采用Games-Howell法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2活性的影響 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2活性的影響（表1）顯示，MMP-1激動(dòng)劑組、抑制劑組及對(duì)照組之間相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=534.328，P＜0.001）；和對(duì)照組相比，激動(dòng)劑組MMP-1活性增高，抑制劑組MMP-1活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。MMP-2激動(dòng)劑組、抑制劑組及對(duì)照組之間相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=250.628，P＜0.001）；和對(duì)照組相比，MMP-2激動(dòng)劑組MMP-2活性增高，MMP-2抑制劑組MMP-1活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2的活性影響

2.2 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)的影響 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)（表2）顯示：MMP-1激動(dòng)劑組、MMP-1抑制劑組及對(duì)照組之間，MMP-1mRNA的相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=174.030，P＜0.001）；與對(duì)照組相比，MMP-1激動(dòng)劑組MMP-1 mRNA的表達(dá)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.009），但MMP-1抑制劑組與對(duì)照組相比，兩組間MMP-1 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.9）。MMP-1激動(dòng)劑組、MMP-1抑制劑組及對(duì)照組之間，Ⅰ型膠原蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=381.946，P＜0.001）；與對(duì)照組相比，MMP-1激動(dòng)劑組Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021），MMP-1抑制劑組Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003）。

MMP-2激動(dòng)劑組、MMP-2抑制劑組以及正常對(duì)照組MMP-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）之間，MMP-2 mRNA總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=126.924，P＜0.001）；與正常對(duì)照組相比，MMP-2抑制劑組MMP-2 mRNA表達(dá)顯著減少（P＜0.001），但MMP-2激動(dòng)劑組與之相比，MMP-2mRNA的表達(dá)無(wú)明顯改變（P= 0.186）；MMP-2激動(dòng)劑組、MMP-2抑制劑組以及正常對(duì)照組中Ⅰ型膠原蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）之間，各組Ⅰ型膠原蛋白mRNA總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.815，P＜0.001）；與對(duì)照組相比，MMP-2激動(dòng)劑組Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達(dá)顯著減少（P= 0.003），MMP-2抑制劑組Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達(dá)顯著增加（P=0.004）。

表2 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白m RNA表達(dá)

2.3 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白水平的影響 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白水平（表3）示：MMP-1激動(dòng)劑組，MMP-1抑制劑組以及對(duì)照組MMP-1表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1062.700，P＜0.001）；與正常對(duì)照組相比，MMP-1激動(dòng)劑組MMP-1表達(dá)明顯增多（P＜0.001），而MMP-1抑制劑組MMP-1表達(dá)明顯減少（P＜0.001）；MMP-1激動(dòng)劑組，MMP-1抑制劑組以及正常對(duì)照組Ⅰ型膠原蛋白各組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1204.000，P＜0.001）；與對(duì)照組相比，MMP-1激動(dòng)劑組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.001），而MMP-1抑制劑組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.001）。MMP-2激動(dòng)劑組、MMP-2抑制劑組以及對(duì)照組MMP-2表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=295.125，P＜0.001）；與對(duì)照組相比，MMP-2激動(dòng)劑組MMP-2表達(dá)明顯增多（P＜0.001），而MMP-2抑制劑組MMP-2表達(dá)明顯減少（P＜0.001）；APMA處理組，MMP-2抑制劑組以及正常對(duì)照組各組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=567.000，P＜0.001）；與正常對(duì)照組相比，MMP-2激動(dòng)劑組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.001），而MMP-2抑制劑組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.001）。

表3 MMPs激動(dòng)劑及抑制劑對(duì)人鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2及Ⅰ型膠原蛋白水平

2.4 siRNA干擾敲除MMPs后，鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2和Ⅰ型膠原蛋白水平的變化 siRNA干擾敲除MMPs后，鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2和Ⅰ型膠原蛋白水平（表4）示：對(duì)照組、MMP-1干擾敲除組、MMP-2干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中，各組MMP-1表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 653.639，P＜0.001）；與對(duì)照組相比，其余各組MMP-1表達(dá)明顯減少（P＜0.001），尤其以MMP-1干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組MMP-1表達(dá)降低最為明顯；對(duì)照組、MMP-1干擾敲除組、MMP-2干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中，各組MMP-2表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 868.458，P＜0.001）；與正常對(duì)照組相比，MMP-2干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中MMP-2蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.001），而MMP-1干擾敲除組中MMP-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變（P＞0.05）；對(duì)照組、MMP-1干擾敲除組、MMP-2干擾敲除組以及MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中，各組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2298.210，P＜0.001）；與對(duì)照組相比，其余各組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.001），其中MMP-1聯(lián)合MMP-2干擾敲除組中Ⅰ型膠原蛋白升高最為顯著（P＜0.001）。

表4 siRNA干擾敲除MMPs后，鞏膜成纖維細(xì)胞MMP-1/2和Ⅰ型膠原蛋白水平

3 討論

眼軸延長(zhǎng)是近視發(fā)展的最基本病理過(guò)程。鞏膜作為近視調(diào)控機(jī)制的最終靶組織，眼軸的延長(zhǎng)總是伴隨鞏膜組織的進(jìn)行性改變。高度近視患者可以發(fā)現(xiàn)鞏膜顯著變薄，尤其在眼球后極部。這種形態(tài)學(xué)的變化，與鞏膜的生物力學(xué)特性密切相關(guān)，變薄的鞏膜中膠原和葡聚多糖含量減少，鞏膜延展性增加［4，7］。鞏膜組織的重塑過(guò)程包括原有組織的降解和新組織的合成，降解與合成之間平衡的改變和近視發(fā)展密切相關(guān)［8-9］。在鳥類、哺乳動(dòng)物以及人類的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，MMPs家族調(diào)節(jié)近視眼鞏膜組織的降解過(guò)程［10-15］。盡管其他MMPs家族成員也可能參與鞏膜組織的重塑過(guò)程，但是MMP-1或MMP-2目前被認(rèn)為是最強(qiáng)的調(diào)控因子［16］。目前有大量文獻(xiàn)研究［10，12，16-19］證實(shí)，無(wú)論是形覺剝奪還是光學(xué)離焦誘導(dǎo)的近視動(dòng)物模型，鞏膜MMP-2表達(dá)增加，細(xì)胞外基質(zhì)降解增加，鞏膜重塑，近視發(fā)生；而在近視恢復(fù)期時(shí)，MMP-2表達(dá)下降。因此，從細(xì)胞水平探討MMP-1/2激動(dòng)劑或抑制劑對(duì)鞏膜成纖維細(xì)胞的作用以及對(duì)Ⅰ型膠原表達(dá)的影響，將能進(jìn)一步揭示鞏膜重塑的機(jī)制。

本研究通過(guò)體外細(xì)胞模型，檢測(cè)MMP-1及MMP-2激動(dòng)劑、抑制劑對(duì)MMP-1或MMP-2以及Ⅰ型膠原mRNA與蛋白水平表達(dá)的影響。結(jié)果表明MMPs激動(dòng)劑引起MMP-1/2活性顯著增加，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)下降，MMPs抑制劑引起MMP-1/2活性顯著下降，相應(yīng)的Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達(dá)增加。盡管數(shù)據(jù)提示MMP-1抑制劑并未引起MMP-1 mRNA表達(dá)的明顯下降，但MMP-1活性明顯下降，MMP-1蛋白表達(dá)減少，鞏膜成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA和蛋白原表達(dá)均增高；類似的，激動(dòng)劑APMA并未引起MMP-2 mRNA表達(dá)的增加，但是MMP-2活性增強(qiáng)，其蛋白表達(dá)增加，導(dǎo)致Ⅰ型膠原mRNA和蛋白原表達(dá)均下降。由此可見，MMP-1/2激動(dòng)劑或抑制劑可引起MMP-1/2活性的改變，伴隨相應(yīng)蛋白表達(dá)的改變，最終影響鞏膜成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原的表達(dá)。其中，MMP-1/2mRNA表達(dá)的變化并不是最關(guān)鍵的因素，而其具有活性成分蛋白表達(dá)的改變才是最終引起Ⅰ型膠原表達(dá)改變的關(guān)鍵因素。

在應(yīng)用siRNA干擾方法敲除MMP-1、MMP-2或同時(shí)兩者均敲除后，MMP-1蛋白表達(dá)均顯著降低，MMP-2除在MMP-1siRNA干擾敲除組無(wú)明顯變化外，其余各組均顯著下降。用siRNA敲除MMP-1/MMP-2，類似于MMP-1/MMP-2被抑制，Ⅰ型膠原的表達(dá)在各敲除組中顯著增加。當(dāng)MMP-1和MMP-2均干擾敲除時(shí)，Ⅰ型膠原的表達(dá)增加最為顯著。由此可見，MMP-1和MMP-2在鞏膜Ⅰ型膠原表達(dá)變化中起關(guān)鍵作用，且兩者之間具有協(xié)同作用。

綜上所述，本研究表明，在人鞏膜成纖維細(xì)胞系中，MMP-1和MMP-2是調(diào)控鞏膜Ⅰ型膠原重塑的關(guān)鍵因子，而鞏膜重塑是近視眼眼軸延長(zhǎng)的重要機(jī)制之一，本研究為今后通過(guò)藥物干預(yù)鞏膜膠原重塑過(guò)程來(lái)防治近視提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of agonists and inhibitors ofmatrix metalloproteinases on expression ofmatrix metalloproteinase 1/2 and collagen I in human scleral fibroblast

ZOU Lei-lei，LIU Rui，LIU Hong，HUANG Li-wen，ZHOU Xing-tao，ZHOU Hao.Departmentof Ophthalmology，Eye Ear Nose and Throat Hospitalof Fudan University，Shanghai 200031，China Corresponding author：LIU Hong，Email：liuhongzef＠263.net

ObjectiveTo investigate the effect of agonist and inhibitor ofmatrixmetalloproteinase-1（MMP-1）and MMP-2 in matrix metalloproteinases（MMPs）on the expression of typeⅠcollagen and the effect of MMP-1 and MMP-2 in the development of human scleral collagen.Methods Human scleral fibroblast line was established as a model.Fluorescent quantitative assay was used to investigate the effect of P-aminophenylmercuric acetate（APMA）and inhibitors of MMP-1 and MMP-2 on MMP-1 and MMP-2 in human scleral fibroblast.Real-time PCR（RT-PCR）and Western-blotwere used to compare the expression ofmRNA and protein levels ofMMP-1、MMP-2 and typeⅠcollagen after exposure to APMA and inhibitors of MMP-1/2.Finally，Gene of MMP-1 or MMP-2 or both were knocked out with small interfering RNA（siRNA）and the expression of typeⅠcollagen was detected.Results APMA significantly improved the activity of MMP-1/2 and decreased the expression of typeⅠcollagen on both mRNA and protein levels（P＜0.01）；inhibitors of MMPs decreased the activity of MMP-1/2 and increased the expression typeⅠcollagen on both mRNA and protein levels（P＜0.01）.APMA increased the expression ofmRNA in MMP-1（P＜0.01）but not MMP-2（P＞0.05）.When gene of MMP-1 or MMP-2 or both were knocked out with siRNA，the protein levels of MMP-1 were significantly decreased（P＜0.01）；MMP-2 were also significantly decreased（P＜0.01）except in the MMP-1 knockdown group（P＞0.05）；TypeⅠcollagen were significantly increased（P＜0.01）especially when the MMP-1 and MMP-2 were both knocked out.Conclusions In human scleral fibroblast line，both agonistand inhibitor could change the activity and the protein level of MMP-1 and MMP-2 and finally change the expression of typeⅠcollagen.MMP-1 and MMP-2 were key factors in rebuilding of typeⅠcollagen in human sclera.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：91-95）

Human scleral fibroblast；Matrixmetalloproteinase 1；Matrixmetalloproteinase 2；Collagen，typeⅠ

2012-12-03）

（本文編輯 諸靜英）

國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（81100689）；上海市科技人才計(jì)劃項(xiàng)目（09PJ1402400）

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031

劉紅（Email：liuhongzef＠263.net）

鄒蕾蕾、劉睿同為第一作者