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    維生素C對大鼠腎小管上皮細胞增殖活力的影響

    2013-02-24 07:47:00周余來
    中國實驗診斷學(xué) 2013年3期
    關(guān)鍵詞:傳代腎小管細胞株

    陳 昕,趙 雷,周余來

    腎臟疾病在臨床具有較高的發(fā)病率,近些年來,隨著相關(guān)醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,許多疾病得到了有效控制,但是,腎衰竭等腎臟疾病尚未得到有效治療,相關(guān)的死亡率也沒有得到明顯的改善,部分慢性疾病常反復(fù)發(fā)作,遷延不愈,其發(fā)病率甚至有逐年增高的趨勢[1,2]。

    目前,部分研究表明,腎小管細胞的損傷,是多種腎疾病的最終促成因素[3-5]。因此,本實驗旨在優(yōu)化大鼠腎小管上皮細胞的培養(yǎng)方法,為腎臟疾病的體外研究提供一定的技術(shù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 清潔級 Wistar大鼠,雌性,體重80-110 g,由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物中心提供,動物許可證號:SCXK-(吉)2007-0003。

    1.2 試劑及儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司,II型膠原酶購自Sigma公司,Percoll分離液購自Pharmacia公司,兔抗大鼠CK-18 IgG單克隆抗體購自北京博鰲森生物技術(shù)有限公司,F(xiàn)ITC-羊抗兔IgG多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司,羊抗兔IgG SABC試劑盒及濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。IX-70倒置相差顯微鏡及正置生物學(xué)顯微鏡均購自日本Olympus公司,F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。

    1.3 大鼠腎小管上皮細胞的分離培養(yǎng) 斷頸處死大鼠,用75%酒精進行全身消毒,開腹取出腎臟,去除腎包膜后,棄去髓質(zhì),剪碎皮質(zhì)后,用PBS反復(fù)沖洗,洗凈殘余血液成分。用0.1%的Ⅱ型膠原酶,于37℃震蕩消化20 min,收集消化液,并用適量PBS溶液洗滌殘余組織塊2次,收集清洗液,消化液和清洗液經(jīng)80目篩網(wǎng)過濾后,1 800 rpm離心5 min收集沉淀。沉淀經(jīng)PBS清洗2-3次后,用DMEM/F12培養(yǎng)基懸起,用45%Percoll分離液進行梯度分離,3 000 rpm離心20 min,進一步分離純化腎小管節(jié)段[6]。將腎小管節(jié)段接種在培養(yǎng)皿內(nèi),用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2條件下,對腎小管節(jié)段進行貼壁培養(yǎng),2-3天換液一次。

    1.4 大鼠腎小管上皮細胞的觀察和鑒定 在腎小管節(jié)段貼壁后,于倒置相差顯微鏡下觀察腎小管上皮細胞的生長狀態(tài),記其生長特征;待腎小管上皮細胞從腎小管組織周圍爬出后,對細胞進行CK-18的免疫組化染色,免疫組化染色過程按SABC和DAB試劑盒操作說明進行,染色結(jié)果于正置生物學(xué)顯微鏡下進行觀察;同時,用流式細胞儀檢測細胞CK-18的表達情況。

    1.5 維生素C對大鼠腎小管上皮細胞增殖活力的影響 將腎小管上皮細胞以1×103cells/well的量種于96孔板中,每孔終體積為100μl,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基進行培養(yǎng),分別在接種后的第0天、第1天和第2天,用CCK-8方法檢測細胞的增殖情況,具體操作方法按CCK-8試劑盒操作說明進行。用此方法對P2、P3代細胞的增殖活力進行初步分析,并檢測在加入不同劑量(10 mg/L、30 mg/L和100 mg/L)維生素C后,P3代細胞的增殖變化情況。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠腎小管上皮細胞的形態(tài)觀察和鑒定結(jié)果

    大鼠腎小管節(jié)段在貼壁12 h后,可見小管節(jié)段形狀明顯改變,培養(yǎng)24 h后,上皮細胞開始從組織內(nèi)爬出,細胞呈鋪路石樣生長(圖1)。細胞在培養(yǎng)一周左右可進行首次傳代。

    流式細胞儀分析結(jié)果顯示:用本實驗方法分離的腎小管上皮細胞,CK-18的表達效率在90%以上,腎小管上皮細胞具備一定的純度(圖2)。免疫組化染色結(jié)果顯示:腎小管上皮細胞的CK18表達呈陽性,陽性率在90%以上,且CK-18主要集中在細胞質(zhì)中表達(圖3)。

    2.2 維生素C對大鼠腎小管上皮細胞增殖活力的影響

    由圖4可見:正常培養(yǎng)的P2代細胞具備一定增殖能力,隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞數(shù)目逐漸增加;

    圖1 腎小管上皮細胞的鏡下觀察形態(tài)

    圖2 CK-18的流式細胞儀檢測結(jié)果

    圖3 腎小管上皮細胞的CK-18免疫組化染色結(jié)果(×200)

    而P3代細胞增殖活性明顯下降,細胞在培養(yǎng)一段時間后不再繼續(xù)生長,甚至逐漸出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,細胞總體數(shù)下降。在維生素C的作用下,P3代細胞可以維持一定的增殖活力,培養(yǎng)時間適度延長(P<0.05),但是,各劑量之間沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05),如圖5所示。

    圖4 腎小管上皮細胞的增殖活力分析結(jié)果

    圖5 腎小管上皮細胞的增殖活力分析結(jié)果

    3 討論

    隨著細胞工程和基因工程技術(shù)的發(fā)展,國內(nèi)外陸續(xù)誕生了多種不同種屬的腎小管細胞株,如:人HK-2細胞株、大鼠NRK-52EA細胞株等。這些細胞株在建系過程中的轉(zhuǎn)基因等永生化技術(shù),可能會導(dǎo)致細胞與在體動物模型存在一定的差異,進而對某些研究會產(chǎn)生影響[7,8]。而原代培養(yǎng)的腎小管上皮細胞,盡管在傳代、培養(yǎng)方面較為不便,但細胞自身生物學(xué)特性與在體細胞更為相似,因此,優(yōu)化腎小管上皮細胞體外培養(yǎng)方法,對一些體外實驗來說仍具有著較為重要的價值[6,9,10]。

    本研究所用方法經(jīng)濟簡便,可用簡易方法適度提高腎小管上皮細胞的生命活性,延長培養(yǎng)時間。但是,本方法仍不能提高細胞的傳代次數(shù),在維生素C存在的條件下,P4代細胞仍不能正常生長,也不能長期培養(yǎng),僅前3代細胞可供體外分析實驗使用,因此,如何能在維持細胞自身特性的前提下,進一步延長腎小管上皮細胞的傳代次數(shù),仍需進一步的探索和研究。

    [1]Wichienkuer P,Naugler W,Wusirika R.Calciphylaxis in a patient with acute kidney injury and alcoholic cirrhosis[J].Clin Nephrol,2011,76(6):499.

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    [5]楊龍飛,朱 娜,宗敏茹,等.水通道AQP2在多囊腎上皮中的表達及意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010,14(4):490.

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