基于常壓室溫等離子體技術誘變選育D-乳酸高發(fā)酵速率菌株

柏中中，孫家奪，吳 斌

（南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211816）

D-乳酸是重要的手性中間體與有機合成原料，廣泛應用于化工、高效低毒農(nóng)藥及除草劑、化妝品等領域的手性合成。近年來，高光學純度的D-乳酸因其在提高聚乳酸材料性能方面的實際應用而得到了更多的關注[1]。目前D-乳酸的工業(yè)生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法。產(chǎn)光學純D-乳酸的微生物主要分布在乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）[2]。與L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)相比，D-乳酸在發(fā)酵菌種的多樣性及發(fā)酵水平方面仍具有較大的差距[3]，因此進一步改良D-乳酸的生產(chǎn)菌株對于擴大乳酸產(chǎn)品的種類和應用領域具有重要的意義。

誘變育種是工業(yè)上提高菌種性能的常用手段。近年來，研究者已利用化學誘變劑、紫外照射及低能離子注入等方法進行D-乳酸高產(chǎn)菌株的選育[4-6]。常壓室溫等離子體（ARTP）具有射流溫度低、產(chǎn)生的等離子體均勻、與生物大分子和細胞作用明顯等優(yōu)點，是快速突變微生物基因組的有效方法。目前已應用于鏈霉菌、茂源鏈輪絲菌及木葡糖酸醋桿菌等微生物的誘變選育[7-9]，但尚未有利用ARTP誘變選育D-乳酸生產(chǎn)菌的報道。

在前期研究過程中，本課題組采用離子束誘變選育獲得一株D-乳酸穩(wěn)定高產(chǎn)菌Sporolactobacillus sp.Y2-8。該菌株搖瓶產(chǎn)酸量達120～140g/L，但發(fā)酵過程中菌體的比生長速率和乳酸產(chǎn)率均相對較低（搖瓶發(fā)酵時間150～160h）[6]，過長的發(fā)酵時間增加了生產(chǎn)成本及發(fā)酵過程中的染菌幾率。本研究以Y 2-8為出發(fā)菌株，利用ARTP選育高產(chǎn)量、高發(fā)酵速率的突變株，為D-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芽孢乳桿菌Sporolactobacillus sp.Y2-8（CCTCC No：M 208052） 由本實驗室選育獲得；酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉等試劑 均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；玉米漿 取自安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司。

常壓室溫等離子生物育種機 北京思清源生物技術有限公司；U-3000型高效液相色譜儀 美國熱電公司；SBA-40型生物傳感儀 山東省科學院生物研究所；雷磁PHS-3E型pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法 固體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，玉米漿2m L/L，KH2PO41，CH3COONa 2，MgSO40.2，瓊脂20，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，玉米漿2m L/L，MgSO40.2，麩皮2，CaCO314，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖150，酵母膏5，玉米漿15m L/L，MgSO40.5，麩皮15，CaCO390，pH 7.0。

高糖-溴甲酚綠篩選平板（g/L）：葡萄糖150，溴甲酚綠0.1，其他組成酵母膏、蛋白胨、玉米漿等組分及其含量與固體培養(yǎng)基組成相同。將生長于固體平板上的菌種接入種子培養(yǎng)基，石蠟液封，搖床轉(zhuǎn)速180r/m in，37℃條件下培養(yǎng)14h，然后以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，石蠟液封，37℃下培養(yǎng)至培養(yǎng)基固化，記錄發(fā)酵時間。

1.2.2 ARTP誘變方法 本研究利用高純氦氣作為工作氣體，通氣量為10L/m in，功率為100W，照射距離2mm，處理菌液10μL。誘變過程的可變操作參數(shù)是處理時間，為了尋找最佳的誘變條件，首先需要獲得菌株的致死率曲線，因此處理時間從5s，依次增加到180s，然后將處理的樣品稀釋涂平板，利用平板計數(shù)法計算致死率[8]，選擇合適的誘變時間。

總之，基層行政事業(yè)單位財務管理工作是一項日常性工作，也是一項十分重要的工作。做好這項工作，基層行政事業(yè)單位必須鎖定財務管理重要性意識鎖，鎖住人才建設這把鎖，掛好財務管理目標鎖，用好財務內(nèi)控管理這把鎖，定好財務管理職責這把鎖，才能用這些鎖把好財務活動這扇大門，防范財務風險于未然。

1.2.3 高通量篩選方法 本研究利用高糖-溴甲酚綠平板作為篩選平板。將誘變后的菌株稀釋涂布于高糖-溴甲酚綠平板，37℃厭氧培養(yǎng)，觀察菌落周圍培養(yǎng)基的顏色變化快慢，選取菌落周圍變色最早最明顯的單菌落進行搖瓶發(fā)酵復篩[6]。

1.2.4 突變株發(fā)酵性能篩選 選取目標菌株進行搖瓶發(fā)酵實驗，比較突變株與原始菌在生物量、葡萄糖消耗量及產(chǎn)D-乳酸性能等方面的差異。

1.2.5 其他分析方法

1.2.5.1 生物量測定 收集發(fā)酵液靜置5m in，小心吸取0.5m L上層清液于試管中，適當稀釋后檢測660nm處吸光值，乘以稀釋倍數(shù)得到菌株生物量OD660。

1.2.5.2 D-乳酸定量分析 采用高效液相色譜進行分析，以檸檬酸為內(nèi)標物（該菌發(fā)酵液中不含檸檬酸，添加量10g/L）。色譜柱，Chromasil C18（Allteck）。流動相，2.5mmol/L NH4H2PO4溶液，流速為0.5m L/m in，柱溫為30℃，檢測波長230nm。

D-乳酸產(chǎn)量的標準曲線：Y=1.668X-0.0043，R2= 0.99992，式中，X：產(chǎn)物D-乳酸與內(nèi)標檸檬酸的峰面積比值；Y：對應的產(chǎn)物D-乳酸的濃度（g/L）。

D-乳酸產(chǎn)率按下式計算：Y=C/T。式中，Y：D-乳酸產(chǎn)率；C：D-乳酸濃度；T：發(fā)酵時間。

1.2.5.4 D-乳酸的光學純度分析 采用高效液相色譜法進行測定，層析柱為Sum ichiral CA 5000，柱溫35℃。流動相，1mmol/L CuSO4溶液，流速為1m L/m in，檢測波長254nm，分析結(jié)果與D-乳酸、L-乳酸標準品色譜圖進行比較。

1.2.5.5 葡萄糖含量測定 采用SBA-40型生物傳感器測定發(fā)酵液中殘留葡萄糖的濃度。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性分析 將復篩所得的高性能菌株在固體平板上進行6代傳代培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵分析其產(chǎn)D-乳酸的性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARTP誘變Sporolactobacillus sp.Y2-8的致死率曲線測定

利用ARTP對菌株Y2-8進行等離子體注入誘變，考察不同注射時間對菌株致死率的影響。由圖1可知，等離子體處理時間與菌株Y2-8的致死率之間存在著明顯的效應關系，隨著照射時間的延長，菌株死亡率迅速增加。在處理60s時，菌株的死亡率為89.2%，處理90s時，菌致死率為95.6%，處理120s以后致死率接近100%。突變具有隨機性，目前菌株致死率與正突變之間的關系仍不十分明確，但大量實驗表明[7-8，10]，致死率在95%左右，可獲得較好的正向突變率。因此本研究選用90s作為菌株誘變的處理時間。

圖1 不同照射時間下的致死率曲線Fig.1 Variation of the lethal rate of Sporolactobacillus sp.Y2-8 with the ARTP treatment time

2.2 高產(chǎn)酸速率突變株的快速篩選

高通量篩選是獲取目標菌株的重要步驟之一。本實驗室在前期的研究過程中，建立了高糖-溴甲酚綠篩選平板[6]，通過比較溴甲酚綠平板上變色圈產(chǎn)生的時間、大小和亮度，篩選獲得11株變色圈產(chǎn)生時間較早且較亮的突變株。而后比較該11株突變株與原始菌在篩選平板上產(chǎn)生變色圈的大小與時間差異，最終獲得了3株目標菌株。分別命名為Y90s-1、Y90s-2和Y90s-3。

2.3 突變株的發(fā)酵性能考察

為進一步了解篩選獲得的3株突變株的培養(yǎng)特性，本研究通過考察3株突變株在搖瓶發(fā)酵過程中的OD值、發(fā)酵液pH、D-乳酸產(chǎn)量及殘?zhí)橇孔兓?，比較突變株與原始菌的發(fā)酵性能差異，結(jié)果如圖2～圖5所示。由圖2可知，突變株Y90s-1的生長明顯較突變株Y90s-2、Y90s-3及原始菌旺盛，發(fā)酵108h后，菌株Y90s-1的OD值達到13.7，而原始菌的OD值為9.7。同時該突變株在發(fā)酵初期pH下降也較快，說明與其他三株菌相比，突變株Y90s-1產(chǎn)生了更多的乳酸，而后隨著發(fā)酵的進行，游離乳酸與中和劑CaCO3反應生成中性乳酸鈣，使發(fā)酵液的pH基本維持在4.5～5之間（圖3）。從圖4可見，突變株Y90s-1發(fā)酵過程中的耗糖速率也明顯快于原始菌和突變株Y90s-2、Y90s-3。進一步比較突變株與原始菌發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的效率，結(jié)果見圖5。在菌株發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，D-乳酸濃度不斷增加，乳酸鈣的含量也不斷增加。當乳酸鈣的含量超過此發(fā)酵溫度下乳酸鈣的飽和濃度時，D-乳酸開始析出，最終整個發(fā)酵液固化。突變株Y90s-1在發(fā)酵116h后，整個發(fā)酵液固化，D-乳酸的濃度為122.4g/L，產(chǎn)率為1.05g/（L·h）。原始菌Y2-8的發(fā)酵固化時間為156h，D-乳酸的濃度為118.4g/L，產(chǎn)率為0.77g/（L·h）。突變株Y90s-1的發(fā)酵時間比原始菌縮短了40h，其D-乳酸生產(chǎn)強度比原始菌提高了36.3%。

圖2 原始菌和突變株的生長曲線Fig.2 The growth curves ofwild strain and mutants

圖3 原始菌與突變株發(fā)酵液pH變化Fig.3 pH of the broth ofwild strain and mutants

圖4 原始菌與突變株的殘?zhí)橇縁ig.4 Fermentation residual sugar ofwild strain andmutants

圖5 原始菌與突變株的D-乳酸產(chǎn)量Fig.5 Fermentation yield of D-lactic acid ofwild strain and mutants

2.4 產(chǎn)物的光學純度分析

利用手性柱分析突變株Y90s-1發(fā)酵產(chǎn)物的光學純度（圖6），結(jié)果表明菌株Y90s-1發(fā)酵所產(chǎn)的D-乳酸光學純度達到了99.9%。

圖6 乳酸標準品及發(fā)酵液樣品的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatogram analysis of the standard of lactic acid and fermentation sample

2.5 遺傳穩(wěn)定性分析

為檢測突變株Y90s-1的遺傳穩(wěn)定性，傳代過程中對各代的突變株進行D-乳酸產(chǎn)量及發(fā)酵時間檢測。從1～6代，D-乳酸的產(chǎn)量及發(fā)酵時間均保持穩(wěn)定（圖7），結(jié)果表明，ARTP誘變選育的菌株Y90s-1保持著良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖7 Y90s-1的遺傳穩(wěn)定性Fig.7 The analysis of genetic stability formutant Y90s-1

3 結(jié)論

本研究采用ARTP誘變選育高發(fā)酵速率的D-乳酸產(chǎn)生菌，這種誘變方法在D-乳酸產(chǎn)生菌選育中首次應用，取得了良好的效果。篩選得到一株發(fā)酵速率提高了36.3%的突變株Y90s-1，并通過傳代實驗驗證了該突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。本研究為D-乳酸產(chǎn)生菌的性能改良提供了一條新途徑。

[1]Wang LM，Zhao B，Li F S，et al.Highly efficient production of D-lactate by Sporolactobacillus sp.CASD with simultaneous enzymatic hydrolysis of peanut meal[J].Appl Microbiol Biot，2011，89：1009-1017.

[2]許婷婷，柏中中，何冰芳.D-乳酸制備研究進展[J].化工進展，2009，28（6）：991-996.

[3]Zheng H J，Gong J X，Chem T，et al.Strain improvement of Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538 for acid tolerance and production of D-lactic acid by genome shuffling[J].ApplMicrobiol Biot，2010，85：1541-1549.

[4]Demirici A，Pometto A L.Enhanced production of D-lactic acid production by mutants of Lactobacillus delbrueckii ATCC9649[J].J Ind Microbiol Biot，1992，11（1）：23-28.

[5]付衛(wèi)明.D-乳酸高產(chǎn)菌株的誘變選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[D].天津：天津大學，2003.

[6]Xu T T，Bai Z Z，Wang L，et al.Breeding of D-lactic acid high producing strain by low-energy ion implantation and preliminary analysis of related metabolism[J].Appl Biochem Biot，2008，160（2）：314-321.

[7]Wang L Y，Huang Z L，Li G，et al.Novelmutation breeding method for Streptomyces avermitilis using an atmospheric pressure glow discharge plasma[J].JAppl Microbiol，2010，108（3）：851-858.

[8]金麗華，方明月，張褕，等.常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性[J].生物工程學報，2011，27（3）：461-467.

[9]張桂才，賈士儒，閆林，等.等離子體注入誘變選育細菌纖維素高產(chǎn)菌株[J].現(xiàn)代食品科技，2010，26（12）：1354-1357.

[10]夏書琴，劉龍，張東旭，等.大氣壓輝光放電低溫等離子體誘變選育谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶高產(chǎn)菌株[J].微生物學通報，2010，37（11）：1642-1649.