微生物對肉鴨肝臟及肌肉中黃曲霉毒素B1殘留的影響

■宋文靜 Latifa Rizka Fidaroin 齊德生 張妮婭

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院飼料與飼料生物技術(shù)實驗室，湖北武漢 430070）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）廣泛存在于花生、玉米、大米等谷物中，是自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的理化性質(zhì)最為穩(wěn)定的一類霉菌毒素，其中AFB1毒性最強。AFB1被動物攝食后，可以通過血液循環(huán)在動物的血液、肝臟、肌肉等可食組織中殘留，進(jìn)而通過食物鏈危害人類健康，并可與乙肝病毒協(xié)同導(dǎo)致肝癌發(fā)病率上升[1]。因此，對AFT脫毒是保證食品衛(wèi)生安全的重要措施。目前AFT的脫毒方法主要有：物理吸附法、化學(xué)法、生物法等。物理法局限性在于成本高，去毒不徹底，經(jīng)過處理的食物保存時間短，易產(chǎn)生二次污染；化學(xué)法局限性在于成本高，去毒不徹底，營養(yǎng)成分損失嚴(yán)重。相對于這兩種方法，微生物法能夠在溫和的條件下去除霉菌毒素，而不影響日糧的營養(yǎng)價值和適口性[2-4]?；谖⑸锓摱镜闹T多優(yōu)勢，人們已經(jīng)做了大量體內(nèi)和體外試驗研究。然而關(guān)于微生物脫毒的動物試驗，大部分停留在對動物生長性能和對健康影響的研究。AFB1不僅可以影響動物生長性能和健康[5-6]，而且可以在動物組織中殘留[7-8]，而目前尚未有微生物對肝臟、肌肉中AFB1殘留影響的報道。本試驗就是基于微生物法，通過在肉鴨日糧中添加微生物研究其對AFB1在鴨肝臟、肌肉中殘留的影響，為生產(chǎn)實踐和食品安全提供一定的理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枯草芽孢桿菌：有效活菌數(shù)為2×1011CFU/g；地衣芽孢桿菌：有效活菌數(shù)為1×1011CFU/g；糞鏈球菌：有效活菌數(shù)為5×109CFU/g；酵母：有效活菌數(shù)為2×1010CFU/g；丁羥甲苯（東化成工業(yè)株式會社）；AFB1：純度≥99%（Sigma公司）。

AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲備液（10 μg/ml）：準(zhǔn)確稱取適量的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈將其溶解配制成10 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃冰箱內(nèi)存儲。

AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用色譜純乙腈逐級稀釋，得到濃度分別為0.5、1、2、4 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 試驗儀器

Agilent1200型液相系統(tǒng)：四元低壓梯度泵、自動進(jìn)樣器、恒溫柱溫箱、真空脫氣機(jī)、熒光檢測器、二級管陣列檢測器；玻璃勻漿機(jī)；離心機(jī)；分析天平：感量0.000 1 g；微孔過濾膜：0.45 μm，水系、油系；旋渦混合器；超聲波清洗器；空氣泵；恒溫水浴鍋。

1.3 色譜條件

色譜柱：型號sinochrom ODS-BP，規(guī)格C8 4.6×250 mm，粒徑5 μm；流動相：甲醇∶乙腈∶水=1∶1∶2(v/v/v)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：50 μl；檢測波長：Ex為360 nm，Em為440 nm。

1.4 AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作液分析步驟

取AFB1的標(biāo)準(zhǔn)工作液1 ml到棕色具塞小瓶中，用空氣泵吹干（60℃吹干，注意不要使液體鼓泡、飛濺）。加入200 μl正己烷和100 μl三氟乙酸，密閉混勻30 s后，在(40±1)℃烘箱中衍生15 min。取出衍生后的樣品溶液，在60℃條件下用空氣泵吹干，用1 ml流動相定容至1 ml，用0.45 μm的微孔過濾膜過濾，待上機(jī)測定。

1.5 試驗動物分組及日糧配制

1日齡的櫻桃谷肉鴨，基礎(chǔ)日糧育雛，適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)選取192只健康、體重相近的雛鴨，隨機(jī)分為6個組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)8只鴨。具體分組見表1?；A(chǔ)日糧參考NRC(1994)肉鴨營養(yǎng)需要量配制，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表1 試驗日糧

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.6 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗于2011年10月28日至2011年12月16日在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料檢測站營養(yǎng)代謝實驗室進(jìn)行。

試驗前1周將鴨舍鴨籠進(jìn)行徹底清掃沖洗、消毒。試驗鴨采用籠養(yǎng)，自由采食和飲水。預(yù)試期1周，正試期6周，分兩階段進(jìn)行,第一階段為第2～4周；第二階段為第5～7周。

1.7 試驗樣品的采集和處理

櫻桃谷肉鴨在42日齡屠宰、采樣。采樣前禁食(自由飲水)24 h。肝臟樣品：將肝臟全部取出，裝于樣品封口袋中，立即放入-20℃冰箱中保存，分析測定其中AFB1殘留量；肌肉樣品：將右側(cè)胸肌、腿肌全部剝離，裝于樣品封口袋中，立即放入-20℃冰箱中保存，分析測定其中AFB1殘留量。

1.8 肝臟、肌肉中AFB1殘留測定

樣品前處理方法參照參考文獻(xiàn)[9]：準(zhǔn)確稱取肝臟和肌肉樣品各4 g，用研缽研磨后，與0.2 ml的20%檸檬酸水溶液和0.4 g硅藻土完全混合，加入4 ml二氯甲烷提取，在室溫下振蕩30 min過濾，加入0.1 g無水硫酸鈉，再次過濾，用空氣泵吹干，加入200 μl正己烷和100 μl三氟乙酸，避光密閉混勻30 s后，在（40±1）℃烘箱中衍生15 min。取出衍生后溶液，在60℃條件下用空氣泵吹干，再用 500 μl流動相定容至 500 μl，在0.45 μm的微孔過濾膜中過濾，最后用高效液相色譜儀檢測。

2 結(jié)果

用高效液相色譜法測得AFB1在6個組的肝臟、肌肉中殘留結(jié)果如表3。污染組的肌肉和肝臟中檢測出AFB1的殘留，肝臟中殘留量為(0.16±0.027)ng/g，肌肉中殘留量為(0.022±0.009)ng/g，其它組肝臟和肌肉中均未檢出AFB1殘留。圖1所示為4 ng/ml的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品在1.3的色譜條件下的峰形圖，此峰基線平穩(wěn)，峰形呈正態(tài)分布，略有前傾現(xiàn)象，無拖尾和分叉現(xiàn)象，保留時間為5.707 min。在污染組肝臟中測得AFB1圖譜如圖2，在污染組肌肉中測得AFB1圖譜如圖3。在處理組1～4肝臟、肌肉中測定的圖譜見圖4和圖5，在對應(yīng)的保留時間無AFB1的峰形出現(xiàn)。由于每次測定受流動相和色譜柱等的影響保留時間略有差異，測定前采用標(biāo)準(zhǔn)品比對可判定AFB1的峰形。

表3 AFB1在肝臟、肌肉中的殘留

圖1 4 ng/ml AFB1標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖2 AFB1肝臟樣品圖譜（污染組，第7周）

圖3 AFB1肌肉樣品圖譜（污染組，第7周）

圖4 處理組肝臟樣品圖譜（處理組，第7周）

圖5 處理組肌肉樣品圖譜（處理組，第7周）

3 討論

AFB1的理化性質(zhì)穩(wěn)定，會在動物血液、組織中存在，并且通過食物鏈對人類健康造成危害[10-12]。研究表明，在基礎(chǔ)日糧中添加100 μg/kg AFB1，持續(xù)飼喂肉雞42 d，在血液和肝臟中殘留量分別為0.051 ng/g和 20.86 ng/g[7]。Zahid Hussain 用含有0、1 600、3 200、6 400 ng/g AFB1的日糧持續(xù)飼喂肉雞 7 d，肝臟中 AFB1殘留量分別為 0、（3.65±0.09）、（3.26±0.23）、（6.59±0.23）ng/g，肌肉中AFB1殘留量分別為0、（0.49±0.05）、（0.77±0.01）、（2.18±0.00）ng/g[8]。本試驗在此基礎(chǔ)上研究低劑量AFB1在肝臟和肌肉組織中殘留量，結(jié)果表明：日糧中低劑量AFB1被動物攝食后，在肝臟和肌肉中有一定程度的蓄積，其中肝臟中殘留量較肌肉中多，這與肝臟是AFB1的靶器官有關(guān)。

很多微生物包括細(xì)菌、酵母菌、霉菌、放線菌和藻類都能夠去除或降解飼料中的AFT[13]。微生物通過非共價鍵與AFT形成AFT-菌體復(fù)合體，形成復(fù)合體后，微生物自身的吸附能力下降，與AFT一起排出體外，從而降低AFT的危害[14]。劉暢等通過對菌體處理方式和吸附時間的優(yōu)化，可使釀酒酵母Y1對AFB1的吸附率達(dá)81.16%[15]。此外，枯草芽孢桿菌[16]、鏈球菌[17]、酵母[18]、乳酸菌[19]、醋酸菌等降解AFT的能力都較強。本試驗研究表明：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌、糞鏈球菌均可降低低劑量AFB1在肝臟、肌肉中的殘留。其吸附量、降低殘留程度去毒機(jī)理將是今后的研究方向。

4 結(jié)論

①AFB1可在鴨的肝臟和肌肉中殘留。本試驗污染組日糧中AFB1的含量分別為10 ng/g(2～4 W)和20 ng/g（5～7 W）條件下，7周后在肉鴨肝臟和肌肉中 AFB1殘留量分別為（0.16±0.027）、（0.022±0.009）ng/g。

②微生物可以有效減少AFB1在肝臟、肌肉中的殘留。本試驗在日糧中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌、糞鏈球菌均可有效降低AFB1在肝臟、肌肉中的殘留。