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    MiR-451在肺癌細(xì)胞A549及肺癌癌組織中的表達(dá)及其意義

    2013-02-20 02:55:54張繼琛閆李俠浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院溫州醫(yī)學(xué)院附屬黃巖醫(yī)院浙江臺(tái)州318020
    吉林醫(yī)學(xué) 2013年4期
    關(guān)鍵詞:逆轉(zhuǎn)錄細(xì)胞株定量

    張繼琛,婁 凱,閆李俠 (浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院,溫州醫(yī)學(xué)院附屬黃巖醫(yī)院,浙江 臺(tái)州 318020)

    微小RNA(miRNA)是一種小的非編碼RNA,與靶mRNA的3'UTR完全或者不完全結(jié)合,降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻譯。miRNA與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、造血調(diào)控和脂肪代謝等過程密切相關(guān)。微小RNA(microRNA)是一類長(zhǎng)約22nt的非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。大量實(shí)驗(yàn)表明miRNA參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的調(diào)控作用[1]。近來,microRNA-451(miR-451)在乳腺癌、卵巢癌及胃癌研究中均有報(bào)道[2-4],但在肺癌方面報(bào)道較少,為探討miR-451在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用,筆者在體外驗(yàn)證miR-451在正常肺細(xì)胞株及肺癌細(xì)胞株的表達(dá)差異,通過臨床標(biāo)本檢測(cè)該小分子在正常肺臟組織、癌旁組織及肺細(xì)胞癌中的表達(dá),為進(jìn)一步探討miR-541在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ),現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料:培養(yǎng)基高糖DMEM購自Hycolone公司,胎牛血清為美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)。Bulge.100p1M miRNA定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒購自ToYoBo公司,PCR試劑盒購自Fermentas公司;其他試劑皆為分析純。CCK.8試劑盒購自蘇州碧云天公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:NSCLC肺癌細(xì)胞株A549由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供。用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞消化后種于96孔板,待細(xì)胞密度達(dá)到30% ~50%采用lipo-2000脂質(zhì)體將不同濃度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR-451模擬物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,每組6孔,轉(zhuǎn)染后0、24 h、48 h、72 h分別采用 WST-8測(cè)定細(xì)胞存活率并繪制生長(zhǎng)曲線,試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.2 組織來源及患者特點(diǎn):共有組織35例,患者年齡45~75歲,所有病例組織來自于溫州醫(yī)學(xué)院附屬黃巖醫(yī)院胸外及呼吸內(nèi)科,標(biāo)本取自手術(shù)切除肺癌組織、肺癌周圍組織以及肺癌周圍正常肺組織。①肺癌組織:取自實(shí)性癌中未壞死的區(qū)域。②癌周組織:肺癌周圍2 cm以內(nèi)的未壞死組織。③正常肺組織:肺癌周圍3 cm以外的未壞死組織。所有患者術(shù)前未接受任何抗腫瘤藥物治療,未進(jìn)行介入治療。組織標(biāo)本離體后,立即放入液氮冷藏,-80℃保持備用。

    1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-451表達(dá)水平:①總RNA的提取:收取細(xì)胞沉淀后直接用Trizol重懸,組織加入1 ml Trizol后用勻漿器研磨,加入200μl氯仿,劇烈震蕩15 s,室溫靜置10 min后,12 000 r/min,4℃離心15 min,吸取上層水相加入等體積預(yù)冷的異丙醇,置于-20℃冰箱30 min以上;再采用12 000 r/min,4℃ 離心 15 min,棄上清,75%乙醇(無 RNA 酶水配置)漂洗RNA沉淀,DEPC水溶解RNA沉淀。根據(jù)Bulge-LoopTMmiRNA定量PCR引物試劑盒說明書操作,取2μg總RNA,加入內(nèi)參U6及目的小分子RNA miR-451逆轉(zhuǎn)錄引物,70℃ 10 min,混合物取出后立即置冰上,冰育2 min,隨后加入逆轉(zhuǎn)錄其他試劑。RT反應(yīng)程序?yàn)?42℃ 60 min,70℃10 min。RT反應(yīng)結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出,快速置冰上冷卻,置-80℃?zhèn)溆?。②?shí)時(shí)定量PCR:以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:10μg 2×SYBR@Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo),10 μmol/L 5'及3'引物0.5 μl,1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,加滅菌雙蒸水至20μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min,95℃ 15 s,60℃20 s,70℃ 10 s,共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)條件:95℃ 15 s,60℃ 15 s,95℃ 15 s。采用相對(duì)定量方法計(jì)算靶miRNA相對(duì)表達(dá)量,計(jì)算公式為:相對(duì)miRNA表達(dá)量=2-(⊿Ct樣品-⊿Ct對(duì)照)。Mir-451及其內(nèi)參U6的引物購于購于廣州銳博生物科技有限公司。③CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖:待測(cè)細(xì)胞96孔板每孔加入10μl CCK-8溶液。同時(shí)用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液,但未加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5~4.0 h。采用酶標(biāo)儀在450 min波長(zhǎng)處測(cè)定A值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-451在正常胚肺細(xì)胞株及肺癌細(xì)胞株中的表達(dá):mir-541在肺癌細(xì)胞(A549)中的表達(dá)比正常肺細(xì)胞顯著降低(0.294±0.066、0.894±0.023),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2 miR-451模擬物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖:分別給予肺癌細(xì)胞株 A549不同濃度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR-145模擬物處理后,不同濃度均可使其增殖能力明顯減弱,5 nmol/L可出現(xiàn)抑制作用,10 nmol/L效應(yīng)明顯,但10 nmol/L同20 nmol/L效應(yīng)無顯著差異,故采用10 nmol/L濃度處理細(xì)胞后進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。細(xì)胞增殖在24 h即出現(xiàn)明顯抑制,72 h仍有抑制效應(yīng)。

    2.3 miR-145在正常組織、癌周組織、癌組織中的表達(dá):在癌組織中表達(dá)顯著低于正常組織與癌周組織(0.124±0.002、0.870±0.034、0.896±0.008),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),前者降低7倍(P<0.05),正常組織及癌周組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3 討論

    miRNA在細(xì)胞的增殖、分化等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。多種miRNAs與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程密切相關(guān),miRNA通過調(diào)節(jié)其靶mRNA的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)或者抑制腫瘤進(jìn)展的作用。作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因子,該小分子的出現(xiàn)對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的闡明、腫瘤治療及預(yù)后均具有重要意義。miR-451為眾多小分子RNA中的一員,miR-451位于染色體17q 11.2,與原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2的17q 11.2-21區(qū)域臨近[5-6]。然而,miR -451在腫瘤方面作用的研究尚處于初級(jí)階段。2005年Ahuvia等首次發(fā)現(xiàn)miR-451[7]。2009年Bandres等研究發(fā)現(xiàn)miR-451與預(yù)后不良相關(guān)[4]。與無瘤組織相比,原位雜交顯示胃癌和結(jié)腸癌上皮細(xì)胞miR-451表達(dá)降低。胃癌細(xì)胞AGS和結(jié)腸癌上皮細(xì)胞DLDI。miR-451過表達(dá)則降低細(xì)胞擴(kuò)增及增加放射敏感性。微陣列及生物信息學(xué)分析鑒別出新的致癌基因巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)是miR-451的潛在靶點(diǎn),而MIF是參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因子[8-9]。2010年 Godlewski等研究 miR -451表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤遷移的影響[10]。2007年Brueckner等研究發(fā)現(xiàn)miRNA-451在支氣管肺泡干細(xì)胞保持自我更新能力中發(fā)揮重要作用,深入研究發(fā)現(xiàn)miR-451通過影響細(xì)胞骨架而調(diào)控遷移[11]。在肺癌與miRNA研究中,2011年蘭海等研究在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)的miR-21對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值和凋亡有重要調(diào)節(jié)作用,抑制腫瘤抑制基因程序性細(xì)胞死亡因子4的表達(dá)[12]。Chen等研究將miR-145轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后,癌細(xì)胞的原癌基因c-myc表達(dá)下調(diào),增殖受到抑制[13]。

    本研究結(jié)果表明,miR-451的低表達(dá)在肺細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用,它可能作為肺細(xì)胞癌惡性行為的重要標(biāo)志,同時(shí)也為治療及預(yù)后提供一些理論基礎(chǔ)。

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