白藜蘆醇通過核因子-κB信號通路抑制腦缺血基質(zhì)金屬蛋白酶功能上調(diào)

朱佳蕾 鄧夏珩 高 麗 顧 昊 沈 偉 郭 軍

(南京醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學中心，江蘇 南京 210029)

白藜蘆醇通過核因子-κB信號通路抑制腦缺血基質(zhì)金屬蛋白酶功能上調(diào)

朱佳蕾 鄧夏珩 高 麗1顧 昊1沈 偉1郭 軍2

(南京醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學中心，江蘇 南京 210029)

目的揭示白藜蘆醇抑制腦缺血基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9功能上調(diào)的分子機制及其與核因子(NF)-κB信號通路聯(lián)系。方法建立大鼠四動脈前腦缺血模型，采用免疫印跡技術(shù)觀察缺血后再灌海馬腦區(qū)MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位的變化;給予自由基清除劑白藜蘆醇或NF-κB抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)，識別NF-κB信號通路是否參與了白藜蘆醇對腦缺血MMP-9蛋白表達的調(diào)控。結(jié)果腦缺血/再灌誘導(dǎo)海馬腦區(qū)MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位增加(P＜0.05)。PDTC能一定程度的抑制缺血后MMP-9基因表達(P＜0.05)。白藜蘆醇能顯著抑制腦缺血NF-κB核易位和MMP-9表達上調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論腦缺血再灌，誘導(dǎo)MMP-9依賴NF-κB通路的蛋白水平增加，白藜蘆醇能通過抑制NF-κB通路下調(diào)MMP-9的功能，繼而阻斷MMP-9激活介導(dǎo)的胞外基質(zhì)降解及海馬腦區(qū)損傷。

腦缺血;白藜蘆醇;MMP-9;NF-κB

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組活性依賴鈣離子和鋅離子的中性蛋白酶家族，在體內(nèi)組成性表達，參與降解各種細胞外基質(zhì)(ECM)〔1〕?，F(xiàn)已識別20多種蛋白，其中MMP-9是MMPs家族的主要成員之一。通過誘導(dǎo)胞外基質(zhì)異常降解，MMP-9參與了多種神經(jīng)性疾病的發(fā)生，如髓鞘脫失、血腦屏障損傷等，而MMP-9在缺血性腦損傷的精確分子調(diào)控機制有待探明。有研究表明:MMP-9的表達上調(diào)及功能異常與自由基產(chǎn)生密切相關(guān)，且其啟動序列具有因子(NF)-κB的識別位點。因而，本研究擬采用具有自由基清除功能的白藜蘆醇及NF-κB抑制劑，檢測腦缺血后海馬腦區(qū)自由基生成及NF-κB信號通路對MMP-9基因表達及功能上調(diào)的影響，繼而揭示天然化合物白藜蘆醇能通過NF-κB信號通路抑制MMP-9，阻斷缺血后胞外基質(zhì)降解，保護海馬神經(jīng)細胞的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康成年雄性SD大鼠來自南京醫(yī)科大學實驗動物中心，體重220～250 g，室溫下飼養(yǎng)。

1.2 抗體 MMP-9和β-actin抗體來源于武漢博士德生物工程有限公司;NF-κB抗體是Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。

1.3 其他試劑 白藜蘆醇購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司;吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)來源于碧云天生物技術(shù)研究所，是國外分裝產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 前腦缺血模型 采用四動脈阻斷法建立前腦缺血模型〔2〕，實驗操作過程符合南京醫(yī)科大學實驗動物使用規(guī)定。水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠;俯臥位固定大鼠，暴露第2頸椎，電灼兩側(cè)椎動脈，造成永久性閉塞;腹側(cè)頸正中切口并分離頸總動脈，絲線標記;電灼24 h后，動脈夾夾住雙側(cè)頸總動脈，使大鼠腦部供血完全阻斷;10 min后松開動脈夾，再灌注12和24 h。該過程要求大鼠在動脈充分阻斷時須滿足下列條件:(1)腦電波完全平坦，(2)瞳孔擴張，(3)無角膜反射，(4)直腸溫度穩(wěn)定(約37℃)。對照組大鼠進行相似的外科手術(shù)但無動脈阻斷。藥物注射實驗組，腹腔注射自由基清除劑白藜蘆醇(200 mg/kg)或相同劑量的生理鹽水。每組動物接受相同的手術(shù)準備和操作方式，以減少手術(shù)過程造成的誤差。

1.4.2 腦室注射 大鼠經(jīng)乙醚麻醉后固定于腦立體定位儀上，使顱骨保持水平位置，用過氧化氫灼燒暴露前囟點。然后用直徑1.5 mm的鉆頭鉆孔，位置為:前自后0.8 mm，旁開1.5 mm，深3.5 mm。利用微量注射器通過單側(cè)腦室注射吡咯二硫氨基甲酸酯(100 mmol/L，4μl)。

1.4.3 各亞細胞組分的分離和蛋白樣本制備 大鼠斷頭取腦，快速分離海馬，并置于1∶10(W/V)的冰冷勻漿液(HEPES 50，pH 7.4，KCl 100，Na3VO41，NaF 50，PMSF 1 mmol/L)中，勻漿器高速破碎組織。4℃低溫離心10 min取上清，為胞質(zhì)和胞膜組分，沉淀為胞核。加勻漿液懸浮胞核沉淀，超聲破碎，離心10 min，取上清為胞核成分。Bradford法測定蛋白含量并將組織樣本調(diào)為等量蛋白濃度，置－80℃保存或直接100℃ ×5 min變性蛋白樣本。

1.4.4 電泳與免疫印跡分析 采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜(NC)。3%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，室溫下一抗孵育4 h，接著TBST洗膜，加入相應(yīng)酶標二抗辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合羊抗兔或抗鼠IgG(1∶10 000)，室溫反應(yīng)2 h，洗膜后，滴加顯色劑，暗室膠片曝光。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血/再灌誘導(dǎo)海馬腦區(qū)MMP-9蛋白水平變化 為了檢測缺血/再灌大鼠海馬腦區(qū) MMP-9蛋白水平變化，采用MMP-9和抗體檢測了MMP-9和β-actin蛋白含量變化。免疫印跡結(jié)果表明:前腦缺血再灌24 h，能誘導(dǎo)pro-MMP-9蛋白含量顯著上調(diào)(P＜0.05)，為空白對照組的2.45倍，而β-actin蛋白水平基本保持穩(wěn)定。提示前腦缺血誘導(dǎo)海馬腦區(qū)MMP-9蛋白含量增加，其功能上調(diào)與缺血性腦損傷密切聯(lián)系，見圖1。

2.2 腦缺血/再灌海馬腦區(qū)NF-κB核易位變化 為評價腦缺血后核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對MMP-9基因表達的潛在機制，采用差速離心結(jié)合免疫印跡技術(shù)觀察了不同亞細胞組分NF-κB及β-actin蛋白水平變化。結(jié)果表明腦缺血再灌12 h能誘導(dǎo)NF-κB胞漿蛋白含量減少(5.88%，P＜0.05)，胞核蛋白顯著增加(429.4%，P＜0.05)，而總蛋白水平基本保持不變(113.2%，P＞0.05)，同時β-actin總蛋白水平基本穩(wěn)定。提示前腦缺血誘導(dǎo)NF-κB核易位增加和功能上調(diào)，可能參與了缺血后腦組織基因表達調(diào)節(jié)。見圖2。

2.3 NF-κB信號通路對腦缺血后pro-MMP-9蛋白水平的調(diào)節(jié)為了證實NF-κB信號通路參與了MMP-9基因表達調(diào)控，采用腦室注射NF-κB抑制劑PDTC，抑制NF-κB信號通路。PDTC能有效下調(diào)缺血/再灌海馬腦區(qū)MMP-9蛋白表達增加，與溶劑組比降低了17.5%，兩者差異顯著(P＜0.05)。提示缺血誘導(dǎo)的NF-κB激活參與了MMP-9基因表達調(diào)控，是其蛋白水平增加及功能上調(diào)的重要分子機制。見圖3。

圖1 免疫印跡檢測腦缺血再灌海馬組織pro-MMP-9蛋白含量變化

圖2 W estern印跡結(jié)合亞細胞分離實驗評價腦缺血再灌海馬組織NF-κB蛋白水平變化

圖3 免疫印跡結(jié)合藥理學實驗分析腦缺血再灌NF-κB抑制劑(PDTC)對pro-MMP-9蛋白水平的影響

2.4 白藜蘆醇對腦缺血后NF-κB核易位和MMP-9表達的影響 為了闡明自由基清除對腦缺血NF-κB功能及MMP-9蛋白水平的影響，腹腔注射白藜蘆醇。免疫印跡檢測表明:白藜蘆醇能顯著性抑制缺血后NF-κB胞漿含量減少和MMP-9蛋白水平增加(80.39%，156.9%)，與溶劑組比有顯著差異(23.53%，264.7%，P＜0.05)。提示腦缺血誘導(dǎo)NF-κB功能上調(diào)及其介導(dǎo)的MMP-9基因表達與自由基生成有密切聯(lián)系，白藜蘆醇通過抑制NF-κB通路，下調(diào)MMP-9胞外基質(zhì)降解功能，減弱腦缺血后神經(jīng)損傷。見圖4。

圖4 白藜蘆醇對腦缺血后NF-κB核易位和MMP-9表達的影響

3 討論

有研究表明〔3〕:白藜蘆醇能清除超氧陰離子、NO、羥基自由基等，減少H2O2產(chǎn)生，顯著抑制氧化性指標丙二醛(MDA)、乳酸(LD)含量增加，恢復(fù)超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱苷肽(GSH)水平，從而減少腦梗死和水腫體積，發(fā)揮氧自由基清除劑的保護功效〔4，5〕。也有學者認為白藜蘆醇對腦缺血后的神經(jīng)保護作用與其抗炎功效、雌激素活性、調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的釋放等有關(guān)〔6～11〕。本研究揭示，白藜蘆醇能通過抑制NF-κB核易位，下調(diào)腦缺血MMP-9蛋白水平，阻斷MMP-9介導(dǎo)的細胞外基質(zhì)降解和血腦屏障損傷，繼而發(fā)揮相關(guān)神經(jīng)保護功能。

MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶。近年越來越多的證據(jù)表明:激活的MMP-9能降解血管周圍基膜主要成分Ⅳ、Ⅴ型明膠膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白〔12〕，觸發(fā)組織繼發(fā)性損傷。MMP-9被確認能定位于腦內(nèi)神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞。腦缺血后，MMP9含量增加，可降解細胞外基質(zhì)成分，破壞神經(jīng)細胞間的聯(lián)系和血腦屏障〔13，14〕，繼而導(dǎo)致炎性細胞(中性粒細胞、巨噬細胞)侵入腦組織，誘導(dǎo)繼發(fā)性炎癥反應(yīng)。同時血腦屏障的破壞也促進了毛細血管內(nèi)水分和血漿蛋白的外滲，造成血管源性腦組織水腫〔15〕;兩者共同觸發(fā)腦組織廣泛損傷，成為腦內(nèi)神經(jīng)功能喪失的重要誘因。

MMP-9的基因表達受多種因素調(diào)控，其中其基因啟動序列－670～ －599，被識別是 NF-κB p65結(jié)合位點，能誘導(dǎo) MMP-9基因轉(zhuǎn)錄起始〔12〕。腫瘤細胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn):NF-κB的高度激活伴隨MMP-9的高表達，是細胞外基質(zhì)降解的重要調(diào)控機制〔16，17〕。本研究證實，腦缺血再灌能刺激 NF-κBp65 的核轉(zhuǎn)位增加，且抑制NF-κB功能能顯著抑制缺血后MMP-9蛋白水平。因而，作為核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κBp65參與了腦缺血MMP-9基因表達調(diào)控，密切聯(lián)系海馬腦區(qū)組織損傷。

綜上所述，白藜蘆醇作為自由基清除劑，能通過抑制腦缺血誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)位，繼而下調(diào)MMP-9基因表達和功能上調(diào)，阻止缺血后MMP-9對胞外基質(zhì)的降解，穩(wěn)定腦組織內(nèi)環(huán)境，降低腦神經(jīng)元損傷，發(fā)揮生物學保護功能。本研究闡明了腦缺血神經(jīng)損傷的分子機制及白藜蘆醇阻止神經(jīng)損傷的新途徑，能為臨床治療缺血性腦卒中提供有益的啟示。

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Effect of resveratrol on NF-κB-induced upregulation of MMP-9 function follow ing cerebral ischem ia

ZHU Jia-Lei，DENG Xia-Heng，GAO Li，et al.
Laboratory Center for Basic M edical Sciences，Nanjing M edical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China

ObjectiveTo explore themolecularmechanisms underlying inhibiting MMP-9 function increasing resulted from cerebral ischemia by resveratrol and its relationswith NF-κB signaling pathway.MethodsFour arterial forebrain ischemiamodel of ratswere established and the changes of MMP-9 protein and NF-κB nuclear transfer were observed by adopting immunoblot assay after ischemia reperfusion in hippocampus.ResultsAfter ischemia reperfusion was adopted，MMP-9 protein level in hippocampus and NF-κB nuclear transfer were induced to increase.PDTC inhibited the increasing of MMP-9 expression to a certain degree after ischemia reperfusion.Resveratrol significantly inhibited NF-κB nuclear transfer and MMP-9 expression after ischemia reperfusion.ConclusionsMMP-9 expression depends on NF-κB pathway is increased as induced by reperfusion after cerebral ischemia.Resveratrol can inhibit the function of MMP-9 through NF-κB pathway，therefore blocking the extracellularmatrix degradation and the damage to the hippocampus areawhich is resulted from the activation of MMP-9.

Cerebral ischemia;Resveratrol;MMP-9;NF-κB

R34

A

1005-9202(2013)05-1073-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.040

國家自然科學基金(81170714);南京市科技發(fā)展計劃科研項目(200901081)

1 南京醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院

2 南京醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系

沈 偉(1971-)，男，副主任醫(yī)師，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事退行性神經(jīng)病變研究。

朱佳蕾(1989-)，女，在讀本科，主要從事神經(jīng)退行性疾病藥理學研究。

〔2011-11-18收稿 2012-03-14修回〕

(編輯 曹夢園)