早發(fā)冠心病患者結(jié)合珠蛋白的基因多態(tài)性

曲 艷 王云英 劉 格 紀(jì)莉莎 張七一 (青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬青島市立醫(yī)院，山東 青島 266011)

結(jié)合珠蛋白(Hp)又稱觸珠蛋白，是一種酸性糖蛋白，主要由肝臟合成，廣泛存在于人類和許多哺乳動(dòng)物的血清及其他體液中，Hp與C-反應(yīng)蛋白(CRP)同屬急性期反應(yīng)蛋白。目前已有大量的臨床研究顯示，CRP水平與冠心病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可作為急性冠脈綜合征判斷預(yù)后的獨(dú)立因素〔1〕，而Hp是否有助于冠心病的診斷，其基因多態(tài)性與冠心病易感性及冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度是否存在相關(guān)性，尚未見到相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。本研究的主要目的是分析早發(fā)冠心病患者結(jié)合珠蛋白基因型頻率的分布，并探討其易感性及其與冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度是否存在相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2010年5月至2011年1月在青島市市立醫(yī)院西院心內(nèi)科住院病人中經(jīng)過冠脈造影確診的冠心病患者92例，年齡男性≤55歲，女性≤65歲(平均52.40歲)。另外選取市立醫(yī)院東院區(qū)體檢中心通過各項(xiàng)臨床檢查完全排除冠心病的74例健康查體者作為對照組，年齡男性≤55歲，女性≤65歲(平均51.27歲)。排除標(biāo)準(zhǔn):所有對象均做血常規(guī)、血生化、12導(dǎo)聯(lián)心電圖、X線胸片、心臟彩超，臨床上需除外既往經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)或冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、心衰病史、心臟瓣膜病、嚴(yán)重心律失常、結(jié)締組織病、急性感染、惡性腫瘤、肝腎功能不全、嚴(yán)重創(chuàng)傷或重大手術(shù)。

1.2 研究分組 所有患者均采用Judkins法行選擇性冠狀動(dòng)脈造影多體位投照。冠心病的診斷根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合冠脈造影結(jié)果，至少一支冠脈血管狹窄大于50%即確診冠心病。采用Gensini冠狀動(dòng)脈評分系統(tǒng)〔2〕(Gensini積分)對冠狀動(dòng)脈的狹窄程度進(jìn)行分組，根據(jù)積分將早發(fā)冠心病患者分為:A組積分＜50分，B組50分≤積分＜90分，C組積分≥90分三個(gè)亞組。Gensini積分〔2〕根據(jù)受試者的冠脈造影結(jié)果，將冠脈分成14段，根據(jù)病變血管不同節(jié)段制定不同的權(quán)重系數(shù)，再根據(jù)冠脈管腔狹窄程度給以不同的權(quán)重系數(shù)，將狹窄程度權(quán)重系數(shù)乘以各病變血管的權(quán)重系數(shù)，最后總積分為各分支血管積分之和。狹窄程度以最嚴(yán)重處為標(biāo)準(zhǔn):狹窄直徑≤25%計(jì)1分，狹窄直徑25% ～50%計(jì)2分，狹窄直徑51% ～75%計(jì)4分，狹窄直徑76% ～90%計(jì)8分，狹窄直徑91% ～99%計(jì)16分，狹窄直徑100%計(jì)32分。病變血管不同節(jié)段權(quán)重系數(shù):左主干×5，前降支近段×2.5，前降支中段 ×1.5，前降支遠(yuǎn)段 ×1，回旋支近段×2.5(開口處×3.5)，回旋支遠(yuǎn)段、鈍緣支、右冠狀動(dòng)脈、后降支及第1對角支均×1，第2對角支及后側(cè)支×0.5。

1.3 Hp基因型的檢測 采集受試者的靜脈血2 ml，EDTA抗凝，置于離心機(jī)內(nèi)以1 800 r/min離心10 min，分離出血漿。用天根公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒提取受試者血液DNA。參考Koch等〔3〕對Hp基因分型的PCR實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分型檢測。分別用引物A和B擴(kuò)增Hp1特異性的1 757 bp片段和Hp2特異性的3 481 bp片段，用引物C和D擴(kuò)增Hp2特異性的349 bp片段進(jìn)一步驗(yàn)證。上游引物A:5'-GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG-3'，下游引物 B:5'-GAGATTTTTGAGCCCTGGCTGGT-3'，擴(kuò)增Hp1特異性的1 757 bp片段和Hp2特異性的3 481 bp片段。PCR反應(yīng)體系包括模板 DNA 5 μl，10×Tap緩沖液(用 MgCl2)2.5 μl，2.5 mm dNTP 混合物 2 μl，10 μm 上下游引物各 0.5 μl，Tap plus DNA 聚合酶(2.5 U/μl)0.5 μl，加入ddH2O補(bǔ)至25 μl體系。上游引物C:5'-CCTGCCTCGTATTAACTGCACCAT-3'，下游引物 D:5'-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3'，擴(kuò)增Hp2的349 bp特異性片段，反應(yīng)體系與上相同。擴(kuò)增條件:在PCR熱循環(huán)儀上擴(kuò)增，95℃預(yù)變性2 min，95℃變性1 min，69℃退火和延伸2 min(A和 B擴(kuò)增時(shí))或1 min(C和D擴(kuò)增時(shí))，共35個(gè)循環(huán)后72℃終末延伸7 min。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)125 V 30 min，在紫外光下觀察，攝影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。冠心病組和對照組Hp基因型頻率分布采用χ2檢驗(yàn)，冠心病亞組間及不同基因型Gensini積分采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HP基因型分型 見圖1所示:條帶1、3、5為引物A、B擴(kuò)增產(chǎn)物，其中750 bp經(jīng)測序?yàn)锽引物單獨(dú)擴(kuò)增序列，不影響結(jié)合珠蛋白基因分型，條帶1、3含1 757 bp為Hp1等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物;條帶2、4、6為引物 C、D 擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶4、6含 349 bp為Hp2等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物。Hp1-1基因型顯示條帶1、2;Hp1-2基因型顯示條帶3、4;Hp2-2基因型顯示條帶5、6。

2.2 早發(fā)冠心病組與對照組患者一般臨床資料比較 性別、年齡、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見表1。早發(fā)冠心病三個(gè)亞組間的性別、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但C組TC及LDL含量較A、B兩組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 各組Hp2-2基因型頻率 早發(fā)冠心病組與對照組間的Hp2-2基因型出現(xiàn)頻率分別為43.48%、54.05%，兩組間Hp基因型分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=1.958，P=0.376)。早發(fā)冠心病組亞組間的 Hp2-2基因型出現(xiàn)頻率分別為28%、50%、77.78%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.953，P ＜0.001)，C 組Hp2-2基因頻率明顯高于A組。且 Hp2-2基因型積分(65.52±40.580)明顯高于Hp1-1基因型(22.50±13.844)和Hp1-2基因型(47.05±25.504)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.214，P ＜0.001)。

圖1 結(jié)合珠蛋白基因型電泳結(jié)果

表1 早發(fā)冠心病組與對照組一般臨床資料比較(s)

表1 早發(fā)冠心病組與對照組一般臨床資料比較(s)

指標(biāo) 對照組(n=74)早發(fā)冠心病組(n=92)P值

表2 早發(fā)冠心病組亞組間一般臨床資料比較(s)

表2 早發(fā)冠心病組亞組間一般臨床資料比較(s)

指標(biāo)A組B組C組P(n=50)(n=24)(n=18)值性別(男性百分比)88.00% 75.00% 66.67% 0.109年齡(歲)51.92±3.238 53.42±3.658 52.39±4.118 0.239 TC(mmol/L)4.628±0.771 4.800±1.004 5.618±1.007 0.000 LDL(mmol/L)2.606±0.636 2.721±0.690 3.340±0.521 0.000

3 討論

CHD是一個(gè)嚴(yán)重危害人類健康的復(fù)雜多因素參與的疾病，早發(fā)冠心病是CHD的特殊形式，其定義為〔4〕:冠心病發(fā)生時(shí)男性＜55歲，女性＜65歲。目前國內(nèi)外研究表明早發(fā)冠心病有增多的趨勢，如何早期預(yù)防及診治已引起廣泛關(guān)注。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)生的基本病變，而氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈的粥樣硬化過程中扮有重要作用。Hp是一種急性期反應(yīng)蛋白，其主要功能是通過與游離血紅蛋白(Hb)結(jié)合形成Hp-Hb復(fù)合物，并很快被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)介導(dǎo)的清道夫受體CD163清除掉，防止Hb對組織的氧化損傷，阻止Hb從腎小球?yàn)V過，避免Hb對腎小管的損害。還具有抗氧化、抗炎、抗菌、促進(jìn)血管生成等作用〔5〕，而Hp的這些生理功能均與防止冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

Hp的分子結(jié)構(gòu)類似免疫球蛋白，即由兩條重鏈(β鏈)和兩條輕鏈(α鏈)組成四聚體，而Hp的多態(tài)性主要是α鏈的遺傳變異造成。α鏈有α1和α2兩種，分別由83個(gè)氨基酸和143個(gè)氨基酸組成。Hpα1和α2肽鏈?zhǔn)怯梢粚Φ任换騂p1和Hp2所決定，基因定位于16q22.1，呈共顯性遺傳，Hp2等位基因不同于Hp1，它包含1.7 kb而Hp1沒有的重復(fù)序列〔6〕，α2多肽鏈?zhǔn)怯搔?鏈的前71個(gè)氨基酸殘基和后72個(gè)氨基酸殘基組成的，β鏈含有245個(gè)氨基酸殘基，分子量大約為45 000 kD〔7〕。根據(jù)α鏈的不同，HP有三種基本基因型:Hp1-1型為Hp1/Hp1;Hp2-1型為Hp2/Hp1;Hp2-2型為 Hp2/Hp2〔8〕。有研究表明不同基因型Hp其結(jié)構(gòu)不同，功能上亦存在差異。Hp1-1型在生物學(xué)功能上結(jié)合游離血紅蛋白的功能是最強(qiáng)的，Hp2-1型次之，而 Hp2-2 型最弱〔9〕。

本研究中早發(fā)冠心病組與對照組間Hp基因型分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示Hp基因型差異與冠心病的易感性無關(guān)，這與國外的研究結(jié)果一致〔10〕。本研究說明Hp2基因可能與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化狹窄程度有關(guān)，即在冠狀動(dòng)脈疾病中，Hp2-2型病人可患有較嚴(yán)重的心肌梗死及并發(fā)癥。原因可能是Hp型別不同，抗氧化劑活性不同，Hp1-1型蛋白與其他型別相比具有更強(qiáng)的抗氧化活性〔11〕，因此Hp1-1型患者更少患冠狀動(dòng)脈疾病，或者有更發(fā)達(dá)的側(cè)支循環(huán)〔12〕。有研究表明，Hp1-1的抗氧化活性強(qiáng)于Hp2-2，并不是因?yàn)镠p1-1與Hb的結(jié)合能力更強(qiáng)，而是因?yàn)镠p1-Hb復(fù)合物穩(wěn)定血紅素中鐵離子的能力更強(qiáng)，而Hp2-Hb復(fù)合物仍具有較強(qiáng)的氧化還原活性鐵〔8〕。其次，Hp2-Hb復(fù)合物經(jīng)清道夫受體CD163被清除的能力最弱〔13〕，導(dǎo)致了體內(nèi)的高的氧化應(yīng)激狀態(tài)，使氧化修飾的低密度脂蛋白增加而對動(dòng)脈內(nèi)膜造成損傷導(dǎo)致冠心病的發(fā)展。本研究中由于樣本量較少，早發(fā)冠心病組92例，按照冠脈狹窄程度分組的病例數(shù)就更少，這可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果的誤區(qū)。下一步應(yīng)行大樣本量的前瞻性研究，以明確Hp2和冠狀動(dòng)脈病變嚴(yán)重程度的相關(guān)關(guān)系，為早發(fā)冠心病的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。

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