再生障礙性貧血小鼠造模方法

邢海燕 胡春萍 蔡雪婷 胡燦紅 曹 鵬 王志剛 (江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028)

再生障礙性貧血小鼠造模方法

邢海燕 胡春萍 蔡雪婷 胡燦紅 曹 鵬 王志剛 (江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028)

目的 探討再生障礙性貧血(AA)小鼠造模方法。方法 三次造模分別采用:免疫介導(dǎo)法:小鼠經(jīng)6.0 Gy60Coγ射線亞致死量全身照射后，由尾靜脈輸入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴結(jié)混合細(xì)胞懸液1×106個細(xì)胞/0.2 ml/只?；旌戏椒?小鼠一次全身3.0 Gy60Coγ射線照射后，分別在第4、5、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg。化學(xué)方法:用苯+玉米油，背部皮下注射，3次/w，共注射15次。同時腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液(50 mg/kg)，每日1次共7次。結(jié)果 免疫介導(dǎo)法造模后模型小鼠在15 d內(nèi)除1只小鼠外全部死亡;混合方法造模，模型小鼠骨髓活檢提示造模失敗;化學(xué)方法造模，造模成功，模型維持時間長。結(jié)論 免疫介導(dǎo)和混合方法造模速度快，對模型小鼠骨髓抑制明顯，與臨床急性AA接近;化學(xué)方法造模周期長，模型小鼠骨髓抑制較輕，與臨床慢性AA接近。

免疫介導(dǎo);混合方法;化學(xué)方法;再生障礙性貧血

再生障礙性貧血(AA)患者多為青壯年，急性病例預(yù)后極差，僅慢性輕型病例有望獲得緩解或治愈。近年來人們?yōu)榱颂接慉A的發(fā)病機(jī)制及篩選有效的治療藥物，做了很多的研究和探討，而研究的深入有賴于良好的AA動物模型的建立。為此，筆者曾經(jīng)在研究AA的藥物治療中，曾先后三次建立AA小鼠模型，本文擬探討一種方法簡便、成功率高、維持時間較長，與人類病理改變相似的AA小鼠模型的建立方法。

1 材料與方法

1.1 方法一

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 近交系 Balb/c小鼠45只，全雌，體重(18±2)g，DBA/2小鼠2只，全雌，體重(18±2)g，作為細(xì)胞供者。兩者均由上海市西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，合格證號SCXK(滬)2008-0016。

1.1.2 胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞懸液制備 將兩只DBA/2小鼠斷頸處死，95%酒精浸泡消毒5 min后，無菌取出胸腺及頸、腋下、腹股溝等處的淋巴結(jié)，加磷酸鹽(PBS)緩沖液，除去表面血污及黏附的結(jié)締組織。再次清洗后，用手術(shù)刀、剪刀反復(fù)剪切組織，研磨直到成糊狀，再經(jīng)尼龍濾血網(wǎng)過濾，使之成為單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)后配成1×106/ml濃度備用。

1.1.3 AA模型建立 取正常BALB/C小鼠45只，隨機(jī)取其中5只作為正常對照組，其余40只參照姚軍等〔1〕方法:將Balb/c小鼠40只經(jīng)6.0 Gy60Coγ射線亞致死量全身3 min照射后，4 h內(nèi)由尾靜脈輸入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴結(jié)混合細(xì)胞懸液0.2 ml，輸注細(xì)胞數(shù)為1×106/0.2 m l/只。

1.2 方法二:

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物 ICR小鼠20只，全雄，體重(18±2)g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 氯霉素(cH)陜西省西安婦幼制藥廠生產(chǎn)，批號:990617;環(huán)磷酰胺(CY)上海華聯(lián)制藥廠有限公司生產(chǎn)，批號:990406。

1.2.3 AA模型建立 20只小鼠一次全身3.0 Gy60Coγ射線照射(劑量率1.353 1 Gy/min，距離170 cm，照射時間2 min 13 s)。照射后第4、5、6天時腹腔注射環(huán)磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg。

1.3 方法三

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物 ICR小鼠50只，全雄，體重(18±2)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.3.2 AA模型建立 50只小鼠分為對照組10只:玉米油，2 ml/kg。背部皮下注射，3次/w(周一，周三，周五)，總共注射35 d。腹腔注射同體積生理鹽水，1次/d，共7次。造模組40只:苯 +玉米油(1∶1配制)，2 ml/kg(1 ml苯 +1 ml玉米油)，背部皮下注射，3次/w(周一，周三，周五)，總共注射15次。同時腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液50 mg/kg(產(chǎn)品批號:11061421，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。1次/d，共7次。造模持續(xù)35 d。

2 結(jié)果

2.1 方法一造模結(jié)果 給藥4 d后，造模組小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎糜、大汗、皮毛稀疏、枯槁、體重明顯下降，在造模后的15 d內(nèi)除1只小鼠外全部死亡。這與文獻(xiàn)報(bào)道的相吻合〔1〕。

2.2 方法二造模結(jié)果 造模結(jié)束后2 d，處死小鼠后，取小鼠股骨的長骨干及干骺端，甲醛溶液浸泡固定后，脫鈣，切片，然后HE染色后觀察骨髓切片病理，低倍鏡觀察組織結(jié)構(gòu):骨髓造血組織增生活躍，干骺端造血組織約占60%，骨干處增生度約為90%，可見三系各階段造血細(xì)胞，分布未見明顯異常。

2.3 方法三造模結(jié)果 造模結(jié)束后2 d，取小鼠眶靜脈血，用全自動血細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)做血常規(guī)計(jì)數(shù)，了解各組小鼠血常規(guī)變化。模型小鼠外周血及骨髓液流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果，較正常組有明顯變化，顯示造模成功，且模型維持時間長。

3 討論

AA小鼠的造模方法有很多種，包括物理，化學(xué)，免疫介導(dǎo)及混合方法等，各種方法各有其特點(diǎn)。物理方法多以γ射線、x射線等以致死量或亞致死量照射;化學(xué)方法中常用的藥物有白消安(馬利蘭)、環(huán)磷酰胺、氯霉素、苯劑等。Muir等〔2〕發(fā)現(xiàn)單純采用放射線造模各系細(xì)胞下降較為明顯，維持周期較長，但其射線還會損傷全身各器官，毒副作用大，照射劑量亦不容易掌握。陳俊等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)，單純照射后第5天骨髓干細(xì)胞數(shù)處于極低水平，但第9天起造血干細(xì)胞開始明顯增加。似乎結(jié)論有相互矛盾之處?；瘜W(xué)藥物中，有研究發(fā)現(xiàn)利用白消安制造的AA動物模型，易使骨髓出現(xiàn)永久性損傷，而不符合造模的要求;張擎等〔4〕以環(huán)磷酰胺大劑量沖擊建立免疫紊亂動物模型，實(shí)驗(yàn)動物雖有外周血常規(guī)一過性減低，但停藥后迅速回升;Lezama〔5〕單純用苯(加玉米油)誘發(fā)的小鼠再障模型，方法簡單，維持時間長，但誘導(dǎo)時間長達(dá)45 d。目前應(yīng)用較多的模型是免疫介導(dǎo)的模型，即將DBA/2小鼠的胸腺淋巴結(jié)細(xì)胞(供體)輸注給受亞致死量照射的Balb/c小鼠(受體)體內(nèi)，建立免疫介導(dǎo)AA模型。但免疫介導(dǎo)模型的建立實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，要求條件高，往往需要專業(yè)人員進(jìn)行，且動物模型死亡快，有報(bào)道造模后第14天除1例外全部死亡〔1〕。

筆者先后三次造模，采用的分別是免疫介導(dǎo)、混合方法及化學(xué)方法，均根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，由相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員嚴(yán)格操作完成。第一次免疫介導(dǎo)法造模，因模型小鼠死亡快，不能滿足實(shí)驗(yàn)藥物療效觀察的要求;第二次混合方法造模，骨髓活檢提示造模失敗，考慮與小鼠射線照射的劑量沒有很好把控有關(guān);第三次化學(xué)方法造模，外周血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞下降明顯，血小板無明顯改變，免疫T細(xì)胞及亞群中CD4+、CD4+/CD8+及CTLA-4+/CD28+的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其他雖有改變但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中CD8+T細(xì)胞數(shù)、CD28+等指標(biāo)的變化與文獻(xiàn)報(bào)道不符。

姚軍等〔1〕認(rèn)為照射和淋巴細(xì)胞的輸入是造模兩個必需的條件，且要求兩者達(dá)一定劑量，任何單獨(dú)一個都不能引起造血衰竭。通過照射不僅降低了造血干細(xì)胞的數(shù)量，引起骨髓儲備力下降，而且削弱了宿主的免疫功能，使得輸入的淋巴細(xì)胞得以生存下來，通過某些途徑對宿主造血系統(tǒng)產(chǎn)生抑制。Chiu等〔6〕研究提示再障的發(fā)生是在骨髓造血干細(xì)胞數(shù)量減少到一定閾值的前提下繼發(fā)于輸入免疫活性細(xì)胞所致的免疫反應(yīng)。陳俊等〔3〕實(shí)驗(yàn)研究提示AA小鼠中存在抑制正常造血細(xì)胞的細(xì)胞，推測它們可能屬于T細(xì)胞，它們究竟是來源于供者小鼠的細(xì)胞，還是來源于受體小鼠本身細(xì)胞仍不清楚。而單純用苯、氯霉素、環(huán)磷酰胺等化學(xué)藥物造模的方法，操作簡便，易于控制。環(huán)磷酰胺是一種免疫抑制劑，苯對骨髓的毒性不在于苯本身而在于苯的有毒代謝產(chǎn)物--氫醌、苯醌等。氫醌通過抑制核因子-κB的活化而使造血前體細(xì)胞對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的凋亡敏感性增高，從而產(chǎn)生造血抑制〔7〕。苯醌可以通過與DNA共價(jià)結(jié)合形成DNA加合物，增加了DNA的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致DNA損傷〔8〕。氯霉素有學(xué)者〔9，10〕認(rèn)為在遺傳敏感的個體中，能直接損傷細(xì)胞DNA，造成骨髓造血干細(xì)胞和微環(huán)境的缺陷，從而導(dǎo)致骨髓造血衰竭。

筆者認(rèn)為，AA分為急性、慢性AA，預(yù)后有明顯差異，故在發(fā)病機(jī)制上兩者有所不同。免疫介導(dǎo)和混合方法形成的AA模型，造模速度快，外周血象及骨髓組織中造血細(xì)胞減少明顯，肝、脾的損傷、組織壞死明顯，與臨床上急性AA比較接近;而單純化學(xué)藥物聯(lián)合造模，造模周期較長，骨髓抑制情況較輕，肝、脾的變化以體積和重量的減少為主，組織壞死不明顯〔4〕，造模小鼠存活時間長，且模型維持時間長，與慢性AA情況比較符合，能滿足實(shí)驗(yàn)藥效的觀察要求。所以，AA小鼠模型的建立方法，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，加以選擇。

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R55

A

1005-9202(2013)23-5888-03;

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江蘇省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目立項(xiàng)計(jì)劃(LB09060)

邢海燕(1971-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤、血液病研究。

〔2012-04-17收稿 2012-09-10修回〕

(編輯 曹夢園)