信號(hào)肽與分泌通路在畢赤酵母表達(dá)異源蛋白中的作用機(jī)制

農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 張 勇 毛若雨 胡小媛

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 滕 達(dá) 王秀敏 王建華＊

飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 大北農(nóng)科技集團(tuán) 王安如＊

大腸桿菌等原核生物表達(dá)系統(tǒng)因缺乏翻譯后修飾系統(tǒng)導(dǎo)致諸多必要生物過程無法完成，如蛋白折疊、糖基化、磷酸化、硫酸化、蛋白質(zhì)順反異構(gòu)、切除蛋白部分起始序列等，使所得重組蛋白具有不溶、不穩(wěn)定、無功能性、具免疫源性等缺陷（Idiris 等 ，2010；Daly 和 Hearn，2005；Makrides，1996）。而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)通過特有的翻譯后修飾功能能有效彌補(bǔ)上述大腸桿菌的缺陷，許多在大腸桿菌中難以表達(dá)的外源蛋白在畢赤酵母中得以成功表達(dá) （Daly 和 Hearn，2005；Lueking 等，2000；Monsalve 等，1999）。畢赤酵母表達(dá)外源蛋白分胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)兩種形式（Doyle等，2009；Zhu等，2009），后者更具應(yīng)用優(yōu)越性，目的蛋白占分泌總蛋白比例高，有利于下游分離純化（Daly和Hearn，2005）。迄今已有1000余種外源蛋白在畢赤酵母中成功分泌表達(dá)，有的表達(dá)量高達(dá)百分?jǐn)?shù)級(jí)，但仍有不少在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有重要價(jià)值的蛋白或多肽，如人巨噬細(xì)胞集落刺激因子（hGM-CSF）、多巴胺D2S受體等無法實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)（Damasceno 等，2011；Liu 等，2005；Macauley等，2005；Mochizuki等，2001）。 為解決這些問題，科學(xué)家從工程酵母構(gòu)建、載體、啟動(dòng)子、培養(yǎng)條件、密碼子、前導(dǎo)肽序列、翻譯信號(hào)等各方面進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，取得了良好進(jìn)展 （Daly和 Hearn，2005）。Idiris等（2010）研究認(rèn)為，除信號(hào)肽外，分泌通路在外源蛋白高效分泌過程中起關(guān)鍵作用，因此成為突破蛋白質(zhì)分泌瓶頸的焦點(diǎn)。本文就畢赤酵母信號(hào)肽關(guān)聯(lián)的分泌機(jī)制、結(jié)構(gòu)特征和蛋白分泌通路改造等方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 信號(hào)肽牽引的外源蛋白分泌通路假說

Gunter Blobel于20世紀(jì)70年代提出信號(hào)肽假說，認(rèn)為蛋白質(zhì)合成在核糖體上進(jìn)行，信號(hào)肽作為蛋白質(zhì)的一個(gè)片段引導(dǎo)核糖體定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通道上，并牽引合成的多肽穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通道，隨后信號(hào)肽被肽酶切除，蛋白質(zhì)被釋放到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，由轉(zhuǎn)運(yùn)小泡轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外。隨后20年Blobel小組對(duì)這一過程做了深入研究，證實(shí)了該假說的正確性和普遍性（Matlin，2011）。畢赤酵母外源蛋白分泌機(jī)制符合“信號(hào)肽假說”理論，根據(jù)蛋白合成初期經(jīng)胞質(zhì)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔轉(zhuǎn)運(yùn)途徑不同分為 “共轉(zhuǎn)運(yùn)”和“翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)”兩種分泌方式。

“共轉(zhuǎn)運(yùn)途徑”在所有細(xì)胞中普遍存在，通過此途徑分泌的蛋白多為膜蛋白，其信號(hào)肽翻譯完成后，信號(hào)識(shí)別顆粒（SRP）識(shí)別信號(hào)肽序列和定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)識(shí)別顆粒受體，牽引新生肽鏈核糖體復(fù)合體至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位子通道 （Idiris等，2010；Kida 等 ，2007；Halic 和 Beckmann，2005；Shan 和 Walter，2005；Mochizuki等，2001）。畢赤酵母表達(dá)蛋白多數(shù)以“翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)”方式分泌胞外，即表達(dá)蛋白翻譯后經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位子通道，其N端信號(hào)肽序列的適度疏水中心具有逃避SRP識(shí)別的功能，待分泌蛋白通過與細(xì)胞質(zhì)中伴侶分子結(jié)合保持未折疊或松散折疊狀態(tài)，在信號(hào)肽牽引下與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上易位子通道蛋白Sec61復(fù)合體結(jié)合，與此同時(shí)ATP偶聯(lián)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔伴侶蛋白Bip通過ATP水解供能結(jié)合于多肽，牽引多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，信號(hào)肽在進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔過程中被信號(hào)肽酶切除掉，而信號(hào)肽C端引導(dǎo)肽則在由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體過程中被位于高爾基體的Kex2 蛋白酶切割掉 （Rapoport，2007；Martoglio 和Dobberstein，1998）。信號(hào)肽被切割后，分泌蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和高爾基體完成翻譯后加工修飾，如蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵形成、糖基化、磷酸化等，這些作用伴隨著蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)而發(fā)生，且蛋白質(zhì)分泌通路伴侶分子直接參與這些過程，之后成熟肽經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)小泡分泌到胞外 （Idiris等，2010；Rapoport，2007；Martoglio和 Dobberstein，1998）。

2 信號(hào)肽結(jié)構(gòu)特征及其在轉(zhuǎn)基因事件中的應(yīng)用

信號(hào)肽是由15～50氨基酸組成的可切割序列，主導(dǎo)分泌過程，多位于分泌蛋白N端，也有位于 C 端的 （Damasceno等，2006；Kutay等，1995）。信號(hào)肽含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：帶正電荷N端（1～5 AA，n-region）、疏水中心（7 ～ 15 AA）和作為信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)的高極性C端（3～7 AA）（Martoglio等，1998；Kutay等，1995）。真核與原核生物信號(hào)肽在結(jié)構(gòu)和功能上具相似性，但真核生物信號(hào)肽三個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)域肽鏈長度比細(xì)菌信號(hào)肽稍短（Von，1990）。這三個(gè)結(jié)構(gòu)域分工負(fù)責(zé)完成蛋白分泌。信號(hào)肽N端正電荷區(qū)域影響蛋白穿膜的啟動(dòng)分泌，Inouye等（1982）對(duì)E.coli脂蛋白N端進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其分別帶上+2，+1，0，-1 個(gè)電荷，脂蛋白產(chǎn)量隨電荷數(shù)增多而增多，而帶負(fù)電荷脂蛋白以未折疊形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。此外，“理想”信號(hào)肽疏水中心的8～10個(gè)Leu也直接影響分泌。Kikucli等（1989）設(shè)計(jì) L8、L14、L6 等一系列信號(hào)肽觀察信號(hào)肽疏水中心Leu含量對(duì)人溶菌酶 （hLZM）在釀酒酵母中心分泌效率的影響，發(fā)現(xiàn)hLZM分泌效率與信號(hào)肽疏水區(qū)肽鏈長度或Leu含量有關(guān)。C端即為信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，在其-1和-3位上常見Pro和Gly等一些不帶電荷的氨基酸殘基，被稱為“（-3，-1）-rule”，或有特定的切割支持作用（Martoglio 和 Dobberstein，1998；Nielsen 等 1997；Von，1989）。

迄今在畢赤酵母成功實(shí)現(xiàn)外源蛋白分泌表達(dá)的信號(hào)肽主要類型包括：（1）釀酒酵母α交配因子前導(dǎo)肽（α-MF）；（2）釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶信號(hào)肽（SUC2）；（3）畢赤酵母酸性磷酸酶信號(hào)肽（PHO1）；（4） 一些蛋白自身信號(hào)肽 （Daly 和Hearn，2005；Cereghino 和 Cregg，2000）。不同信號(hào)肽對(duì)畢赤酵母表達(dá)分泌外源蛋白有不同影響，（Damasceno 等，2011；Daly 和 Hearn，2005）。α-MF信號(hào)肽在畢赤酵母表達(dá)中應(yīng)用最為成功。α-MF源自于釀酒酵母α交配因子N端85氨基酸前導(dǎo)肽序列，包括N端19氨基酸信號(hào)肽和3個(gè)天冬氨酸連接糖基化的65肽（Waters等，1988）。關(guān)于外源蛋白在α-MF牽引下實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)的研究報(bào)道較多。Chandrasekhar等（2010）利用α信號(hào)肽成功實(shí)現(xiàn)了Insulin在畢赤酵母X-33中高效分泌表達(dá)，其產(chǎn)量高達(dá)到3.84 g/L；Zhang等（2011）利用含α信號(hào)肽的pPICZαA載體成功實(shí)現(xiàn)了plectasin及多拷貝基因在畢赤酵母X-33中的高效表達(dá)；同時(shí)，α信號(hào)肽在應(yīng)用中較其他信號(hào)肽更為有效。Ghosalkar等（2008）用IFN-a2 b自身信號(hào)肽及α信號(hào)肽在畢赤酵母GS115中分泌表達(dá)，結(jié)果表明，α信號(hào)肽引導(dǎo)的目的蛋白高效分泌，產(chǎn)量達(dá)200 mg/L，而自身信號(hào)肽引導(dǎo)的不能分泌表達(dá)。Tanaka等（2004）使用嗜酸性木聚糖酶自身信號(hào)肽、α信號(hào)肽、酸性磷酸酶（PHO1）信號(hào)肽在GS115中分泌表達(dá)，結(jié)果顯示，α信號(hào)肽引導(dǎo)的目的蛋白分泌表達(dá)量為其他兩個(gè)信號(hào)肽的2倍。

酸性磷酸酶信號(hào)肽在畢赤酵母異源表達(dá)中應(yīng)用也較多。Eldin等（1997）用酸性磷酸酶信號(hào)肽構(gòu)建pHIL-S1表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了單鏈抗體G5 sFv片段在GS115分泌表達(dá)，獲純化產(chǎn)品100～250 mg/L。木聚糖酶 （XynI）也通過酸性磷酸酶信號(hào)肽在GS115中成功分泌表達(dá)，純化后產(chǎn)量達(dá)100 mg/L，但其產(chǎn)量略低于 α信號(hào)肽 （Koganesawa等，2001）。

大量研究表明，同一蛋白質(zhì)可通過多種信號(hào)肽在畢赤酵母中分泌表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異（Baumgartner等，2002；Koganesawa 等，2001）。 一些蛋白質(zhì)自身攜帶的信號(hào)肽可能更便于在畢赤酵母分泌表達(dá)中發(fā)揮作用，如Baumgartner等（2002）將攜帶自身信號(hào)肽 PHA-E基因插入pPICZB載體并轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33，植物血凝素表達(dá)量達(dá)100 mg/L，并具天然PHA-E同等生物活性。此外植物凝集素借助α信號(hào)肽也在畢赤酵母實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，但目的蛋白氨基端信號(hào)肽加工困難，產(chǎn)物無活性（Daly和 Hearn，2005）。盡管諸多外源蛋白質(zhì)在畢赤酵母成功高效表達(dá)，但仍有一些蛋白難以在畢赤酵母中分泌表達(dá)、或表達(dá)量低、信號(hào)肽加工難等 （Chandrasekhar等，2010；Li等，2009；Xie等，2008）。 目前提高外源蛋白在畢赤酵母中分泌表達(dá)量是研究熱點(diǎn)，其中信號(hào)肽及分泌通路改造是實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)的上游工作（Maresova 等 ，2010；Zhao 等 ，2009；Cereghino 和Cregg，2000）。

3 信號(hào)肽及外源蛋白分泌通路改造

3.1 信號(hào)肽Kex2切割位點(diǎn)序列改造 信號(hào)肽Kex2切割位點(diǎn)序列改造是提高外源蛋白分泌效率的常見策略之一 （Chandrasekhar等，2010；Maresova 等 ，2010；Xie 等 ，2008；Daly 和 Hearn，2005）。異源蛋白畢赤酵母分泌表達(dá)依賴于信號(hào)肽的牽引作用，后者在分泌過程中被Kex2蛋白酶所切割。該酶是酵母自身編碼的具有Ca2+依賴性絲氨酸蛋白酶，屬枯草桿菌蛋白酶家族，其加工蛋白前體、切除信號(hào)肽的特異性酶切位點(diǎn)為Lys-Arg/Arg-Arg/Pro-Ar （Rockwell和 Thorner，2004；Fuller等，1989）。研究表明，Kex2蛋白酶對(duì)Lys-Arg-位點(diǎn)的切割效率最高 （Southey等，2008；Bevan 等，1998）。 Bevan 等（1998）對(duì) Kex2 不同切割位點(diǎn)的切割效率進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，Kex2對(duì)Lys-Arg-位點(diǎn)切割效率比Arg-Arg/Pro-Arg-要高。但Kex2蛋白酶往往由于切割效率不足導(dǎo)致目的蛋白N端帶有未切除完整的信號(hào)肽序列（Zhao 等，2009；Kozlov 和 Yagudin，2008；Vedvick等，1991）。相關(guān)研究也表明，Kex2酶切位點(diǎn)的前后臨近序列對(duì)酶的切割效率有很大影響，優(yōu)化Kex2切割位點(diǎn)序列可有效提高Kex2切割效率，從而提高目的蛋白產(chǎn)量，該措施在胰島素表達(dá)中應(yīng)用較為成功 （Chandrasekhar等，2010；Wang和Ward，2008；Rozan，2004；Kjeldsen 等 ，1998）。Chandrasekhar等 （2010） 在 pPICZαA 載體 Kex2切割位點(diǎn)KR后添加EEAEAEPK間隔序列，使胰島素前體在畢赤酵母X-33中產(chǎn)量提高2倍。Xie等（2008）在pPIC9K載體Kex2切割位點(diǎn)后也添加相同間隔序列，使胰島素前體在畢赤酵母GS115分泌量增到3.6 g/L。此外，多功能氧化酶、青霉素酰胺化酶、牛胰腺RNA酶A、β乳球蛋白等重組畢赤酵母均有類似酶切序列成功改造的案例。研究表明，在載體Kex2切割位點(diǎn)和目的基因間插入EAEA間隔序列，均能增加Kex2切割效率，提高目的蛋白產(chǎn)量（Garcia 等，2012；Maresova等，2010；Li等，2009；Kim，1997）。但另一衍生問題是由于二肽酶Ste13對(duì)EAEA序列切割效率不高，使切割后目的蛋白N端帶有延伸EA序列，多余的EA序列對(duì)目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能的影響值得關(guān)注。也有研究表明，Kex2切割位點(diǎn)前的序列對(duì)于Kex2切割效率有一定的影響，對(duì)Kex2切割位點(diǎn)前的序列改造也可有效提高Kex2蛋白酶切割效率，使信號(hào)肽切割效率達(dá)100%，在緊鄰Kex2蛋白酶切割位點(diǎn)序列前插入四肽序VAVE/VAFE/VAIE，可使信號(hào)肽被完全切割 （Wang和Ward，2008）。以上研究表明，信號(hào)肽切割位點(diǎn)臨近序列改造的確能提高切割效率。

3.2 分泌通路對(duì)外源蛋白分泌效率的影響 外源蛋白翻譯后修飾是伴隨著蛋白分泌過程而發(fā)生的，在分泌通路作用下實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵形成、磷酸化等翻譯后修飾，這些分泌通路因子大多為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔伴侶蛋白。目前關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)合于新生多肽疏水區(qū)促進(jìn)蛋白折疊的伴侶蛋白 Bip、二硫鍵異構(gòu)酶PDI、伴侶蛋白Sec63及伴侶蛋白輔因子YDJ1p和Ssa1p等對(duì)蛋白分泌效率的影響已被證實(shí)。PDI作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔伴侶蛋白，同時(shí)也是蛋白質(zhì)二硫鍵形成異構(gòu)酶，其與外源蛋白共表達(dá)能有效提高外源蛋白分泌量（Idiris等，2010）。 Inan 等（2006）用畢赤酵母X-33表達(dá)可作為十二指腸蟲疫苗的美洲板口線蟲分泌性蛋白Na-ASP1，發(fā)現(xiàn)增加基因拷貝數(shù)反而使Na-ASP1表達(dá)量減少，而將Na-ASP1與PDI共表達(dá)卻使Na-ASP1分泌表達(dá)產(chǎn)量增加，且與Na-ASP1基因拷貝數(shù)有一定相關(guān)性。為探索各伴侶分子Bip、Sec63、PDI及輔因子YDJ1p和Ssa1p促進(jìn)外源蛋白分泌效率的差異及互作，Zhang等（2006）分別將類激素蛋白（G-CSF） 分別與 Bip、Sec63、PDI、YDJ1、Ssa1p 在畢赤酵母GS115中共表達(dá)，結(jié)果G-CSF分別與Bip、Ssa1p、PDI共表達(dá)的分泌量提高了4～7倍；將 G-CSF 分別與 YDJ1/PDI、YDJ1/Sec63、Bip/PDI三個(gè)基因共表達(dá)，使G-CSF分泌產(chǎn)量分別提高8.7、7.6、6.5倍，認(rèn)為多個(gè)伴侶蛋白共表達(dá)具顯著的協(xié)同作用。

4 小結(jié)

綜上所述，畢赤酵母兼具原核表達(dá)系統(tǒng)的“高效性”和真核表達(dá)系統(tǒng)的“優(yōu)質(zhì)性”優(yōu)勢，是表達(dá)各種功能蛋白和多肽的理想平臺(tái)。突破蛋白質(zhì)或多肽在畢赤酵母中高效分泌表達(dá)瓶頸往往對(duì)功能產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化至關(guān)重要。從受體菌、載體、啟動(dòng)子、密碼子、培養(yǎng)條件等因素入手均已被證明是提高蛋白分泌效率的有效途徑，但是基于信號(hào)肽尤其是信號(hào)肽通路元件或結(jié)構(gòu)因子的改造與優(yōu)化，或許是目前突破表達(dá)瓶頸的革命性技術(shù)策略之一，今后畢赤酵母高效分泌表達(dá)異源蛋白的主攻突破方向包括以下兩點(diǎn)：一是信號(hào)肽及分泌通路改造與優(yōu)化，這一環(huán)節(jié)為以往同類工作所忽略，既需要基于不同目標(biāo)蛋白特性的個(gè)案研究，更需要積累大量工作以發(fā)現(xiàn)新的構(gòu)效規(guī)律，獲得具有普遍性的高效分泌表達(dá)的技術(shù)解決方案；二是蛋白質(zhì)翻譯后修飾（蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊、糖基化等）和質(zhì)量控制系統(tǒng)（QC、UPR），及分泌蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)因子和輔助條件的系統(tǒng)研究。

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