高蛋白酶解及抗?fàn)I養(yǎng)因子降解菌株的篩選

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 王婧瑤 劉 威 曹蕾蕾 葉忠雪 王立群＊

黑龍江華森畜牧科技有限公司 張劉運(yùn) 張日闊

豆粕作為一種質(zhì)量穩(wěn)定的植物蛋白源，因其供應(yīng)充足，氨基酸組成合理，含有異黃酮、脂肪酸、礦物質(zhì)等生物活性物質(zhì)及營養(yǎng)成分，日漸受到人們的青睞（余龍江等，2003）。然而，豆粕卻有其自身的局限性。一方面，豆粕主要是由大分子蛋白構(gòu)成，不能像小分子蛋白——寡肽和游離氨基酸被機(jī)體充分吸收。另一方面，豆粕中含有大量抗?fàn)I養(yǎng)因子，特別是其中的胰蛋白酶抑制因子和植酸含量較較高，均可達(dá)到2%左右，這不僅降低動(dòng)物機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用，也其影響健康（游金明等，2006；石慧，2006）。本研究即以蛋白酶活力、酸溶蛋白、游離氨基酸以及胰蛋白酶抑制因子和植酸含量為指標(biāo)，采用紫外線誘變的方法，通過發(fā)酵豆粕篩選出可提高其中小分子蛋白含量且降低抗?fàn)I養(yǎng)因子作用的優(yōu)良菌株，使得發(fā)酵后的豆粕更有利于動(dòng)物的消化和吸收，從而提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 菌株JY，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 脫脂奶粉瓊脂培養(yǎng)基：脫脂奶粉40 g、瓊脂20 g、水1000 mL。奶粉和瓊脂分開滅菌，121℃下滅菌15 min，降溫至80℃后混勻。脫脂奶粉瓊脂雙層平板：9 cm直徑的培養(yǎng)皿中注入融化的2%瓊脂10 mL，冷凝后再注入脫脂奶粉瓊脂培養(yǎng)基10 mL。液體種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、氯化鈉5 g、水1000 mL，121℃滅菌15 min。豆粕培養(yǎng)基：豆粕 40 g、糖蜜 1 mL、水 34 mL，均裝入 250 mL三角瓶，121℃滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株誘變條件確定 菌株JB在液體種子培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)了8 h即為出發(fā)菌株，滅菌水稀釋成10-6、10-7和10-8三個(gè)濃度梯度，各濃度分別涂布脫脂奶粉瓊脂雙層平板（試驗(yàn)組），所涂平板垂直置于30 W紫外燈下，15 cm照距照射10、20、30、40、50、60、90 s和 120 s， 設(shè)相應(yīng)無照射對(duì)照組，照后黑布包好，37℃培養(yǎng)24 h，計(jì)算致死率，以試驗(yàn)組雙層平板上適宜的菌落密度（6～12個(gè)）確定出發(fā)菌株最佳稀釋濃度和照射時(shí)間。

1.2.2 菌株誘變及初篩 以上述條件為依據(jù)進(jìn)行批量誘變，并以其培養(yǎng)后雙層平板上的菌落直徑（c）及透明圈直徑（h）之比 K 值（h/c）進(jìn)行初篩，取K值大于4的菌落純培養(yǎng)，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌株的復(fù)篩 初篩菌株于液體種子培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12 h活化用于復(fù)篩檢測。其中蛋白酶活力、酸溶蛋白含量和游離氨基酸含量為菌株蛋白酶解能力的測定指標(biāo)；而胰蛋白酶抑制因子含量和植酸含量為菌株降解抗?fàn)I養(yǎng)因子能力的測定指標(biāo)。

一部分活化菌液經(jīng)Folin酚法測定蛋白酶活力（黃秀梨等，2008）。另取活化菌液5 mL接種到裝有豆粕培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、72 h固態(tài)發(fā)酵，后進(jìn)行檢測。測定指標(biāo)及方法如下：（1）三氯乙酸沉淀法測酸溶蛋白含量 （朱平軍等，2011）；（2）以水合茚三酮法測游離氨基酸含量（何照范等，1998）；（3）以改進(jìn)的 BAPNA 法測胰蛋白酶抑制因子含量（盧曉凌，2009）；（4）以三氯化鐵比色法測植酸含量（傅啟高等，1997）。以對(duì)出發(fā)菌的上述處理作為對(duì)照。

1.2.4 菌株鑒定 所獲優(yōu)良菌株通過菌體、菌落特征和生理生化特征進(jìn)行鑒定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)采用SPSS 13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行一維方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。試驗(yàn)結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株誘變條件 從表1可見，所試稀釋梯度在處理時(shí)間分別為40、30和20 s時(shí)，相應(yīng)平板上菌落數(shù)分別為50、10和3，同時(shí)各致死率亦均為75%。紫外線誘變育種中，往往以致死率確定誘變劑量，且在70%~80%時(shí)誘變效果最好，所以若只考慮到紫外誘變的劑量要求，則所試3個(gè)稀釋梯度在照射時(shí)間40、30 s和20 s時(shí)完全符合（張克旭和陳寧，1998），但考慮到在9 cm直徑的平板上觀測菌落及其周圍蛋白水解透明圈的可操作性及準(zhǔn)確性，所以本試驗(yàn)在30 W紫外燈、照距15 cm的前提下，選擇稀釋梯度為10-7、菌落數(shù)為10及紫外線誘變時(shí)間為30 s的條件進(jìn)行后續(xù)的菌種的批量誘變。

2.2 優(yōu)良菌株誘變及初篩結(jié)果 經(jīng)上述條件批量誘變后，共得到K值大于4的突變菌15株，命名為 JY1、JY2……JY15。

表1 不同誘變條件下平板上的菌落數(shù)/致死率%

2.3 優(yōu)良菌株復(fù)篩結(jié)果 15株初篩菌株蛋白酶解能力和抗?fàn)I養(yǎng)因子降解能力測定結(jié)果見表2和表3。

表2 初篩菌株蛋白酶活力及豆粕發(fā)酵后酸溶蛋白和游離氨基酸含量

表3 篩選后所獲菌株的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量測定結(jié)果mg/g

由表2可見，15株菌蛋白酶活的表觀測定值均較高， 尤其是菌株 JY15、JY13、JY11、JY14 和JY8與對(duì)照組的差值較大（P＜0.01）。說明這5株菌產(chǎn)蛋白酶能力較強(qiáng)。15株菌酸溶蛋白的表觀測定值均較高，尤其是菌株 JY15、JY3、JY14、JY2 和JY12極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。酸溶蛋白一般是酶解天然大分子蛋白的產(chǎn)物，可以溶解在三氯乙酸中，分子質(zhì)量均在10 kD以下，包括寡肽和游離氨基酸。這類酸溶蛋白在飼料中被動(dòng)物機(jī)體的吸收率遠(yuǎn)高于天然大分子蛋白。所以說飼料中酸溶蛋白含量的提高即意味著飼料營養(yǎng)價(jià)值的提高。 因此菌株 JY15、JY3、JY14、JY2 和 JY12 在飼料微生物發(fā)酵中更具有使用價(jià)值。15株菌游離氨基酸表觀測定值均較高，尤其是菌株JY2、JY9、JY11、JY12、JY13、JY14 和 JY15 的游離氨基酸表觀測定值極顯著高于對(duì)照組 （P＜0.01）。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)消化、吸收理論認(rèn)為，蛋白質(zhì)在腸腔內(nèi)由胰蛋白酶和糜蛋白酶作用生成游離氨基酸和寡肽（也稱小肽，含2～20個(gè)氨基酸殘基，常指含2～6個(gè)氨基酸殘基的寡肽），寡肽在肽酶的作用下完全被水解成游離氨基酸，并以游離氨基酸形式進(jìn)入血液循環(huán)。所以傳統(tǒng)理論認(rèn)為游離氨基酸的含量決定了飼料的營養(yǎng)價(jià)值。

綜合以上的結(jié)果，三個(gè)指標(biāo)中均與對(duì)照組差異極顯著的菌株有JY14和JY15，選擇上述兩株進(jìn)行抗?fàn)I養(yǎng)因子降解能力的驗(yàn)證。

由表3可見，JY14和JY15菌胰蛋白酶抑制因子含量與對(duì)照組比均達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01）。同時(shí)，JY15與 JY14相比，差異也極顯著（P＜0.01）。胰蛋白酶抑制因子一方面可與動(dòng)物小腸液中胰蛋白酶結(jié)合成無活性的復(fù)合物，降低胰蛋白酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)消化利用率降低，造成外源氮損失；另一方面結(jié)合后胰蛋白酶大量補(bǔ)償性分泌，造成蛋白質(zhì)的內(nèi)源性消耗、氨基酸代謝不平衡，影響動(dòng)物機(jī)體生長。胰蛋白酶抑制因子的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其降低原因是微生物分泌的酶系，尤其是一些蛋白酶，對(duì)胰蛋白酶抑制因子產(chǎn)生了一系列的作用，使之部分降解。

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，上述兩株菌植酸含量與對(duì)照組比均達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01）。同時(shí)，JY15與JY14相比，差異也極顯著（P＜0.01）。植酸在動(dòng)物消化道的酸度條件下，會(huì)與二價(jià)金屬離子、帶正電的蛋白質(zhì)、氨基酸發(fā)生反應(yīng)，生成絡(luò)合物及復(fù)合物，它們不僅基團(tuán)之間親和能力強(qiáng)，且其本身難溶解，不僅影響磷的利用率，同時(shí)還影響礦物質(zhì)元素、蛋白質(zhì)、氨基酸利用率，甚至對(duì)淀粉酶、脂肪酶的活性均有抑制作用。植酸是B族維生素的一種肌醇六磷酸酯，其降低的原因是微生物的大量繁殖將其消耗利用或產(chǎn)生的植酸酶使其含量下降。

2.4 菌株鑒定結(jié)果 該菌菌落呈扁平狀，菌落擴(kuò)散、邊緣整齊，表面濕潤，光滑，較黏稠；革蘭氏染色陽性；芽孢為橢圓形，中生或側(cè)生。生理生化特征為：好氧菌，接觸酶反應(yīng)為陽性。根據(jù)JY15菌株的形態(tài)和生理生化特征，并依據(jù)《微生物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）進(jìn)行菌種鑒定，該菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

3 討論

3.1 菌株的紫外線誘變 本研究中10-7稀釋梯度下得到的10個(gè)菌落，在平板上表現(xiàn)為均勻分散、彼此獨(dú)立、透明圈清晰可見。當(dāng)誘變時(shí)間短、稀釋倍數(shù)低時(shí)，誘變后平板上菌落雖然可計(jì)，但是透明圈相連，無法計(jì)算K值；而當(dāng)誘變時(shí)間長、稀釋倍數(shù)高時(shí)，其上的菌落數(shù)目則太少、外環(huán)境的輕微影響極易導(dǎo)致平板上無菌落，因此也不適宜批量操作。

對(duì)于菌株紫外線誘變步驟，大多試驗(yàn)研究均采用紫外線照射菌液，后吸取一定量涂布平板（鞠華偉等，2007；牛春華，2011）。然而實(shí)際操作卻發(fā)現(xiàn)此方法得到的菌落數(shù)目極其不穩(wěn)定。原因有兩個(gè)：一是培養(yǎng)皿底凹凸不平；二是吸取誘變菌液的含菌量（菌個(gè)數(shù)）難以恒定。為此本研究中，巧妙的采用紫外線照射涂布菌液后的平板，而使得各平板上的菌落數(shù)穩(wěn)定一致，便于批量操作，為紫外線誘變育種的照射環(huán)節(jié)開拓了一個(gè)簡便、易行的良好方法。

3.2 菌株發(fā)酵對(duì)原料中蛋白含量的影響 傳統(tǒng)理論認(rèn)為蛋白質(zhì)是為動(dòng)物機(jī)體提供氨基酸的營養(yǎng)源，且只有游離氨基酸才可被動(dòng)物機(jī)體吸收利用；而新的觀點(diǎn)則認(rèn)為寡肽的吸收更具優(yōu)越性，因其不僅具有高效吸收、低耗能等特點(diǎn)，又可避免游離氨基酸之間的吸收競爭，同時(shí)一定的寡肽和游離氨基酸比例也會(huì)促進(jìn)動(dòng)物的吸收作用，因此通過酸溶蛋白含量測定評(píng)估飼料蛋白的優(yōu)劣便成為了現(xiàn)階段被廣泛推廣的方法。而本試驗(yàn)采用檢測蛋白酶解能力的兩個(gè)指標(biāo)：酸溶蛋白含量和游離氨基酸含量，兼顧了傳統(tǒng)理論，將新舊觀點(diǎn)做了最大限度的平衡。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)獲得的菌株JY15發(fā)酵豆粕可提高其小分子蛋白含量，同時(shí)也降低了抗?fàn)I養(yǎng)因子水平（P ＜ 0.01）。

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