T型鈣離子通道在癲癇發(fā)生中的作用研究進(jìn)展☆

呂楠 肖波

T型鈣離子通道為一種低電壓依賴性鈣通道，通過改變細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度及神經(jīng)元的興奮性發(fā)揮其獨(dú)特的生物學(xué)特性。T型鈣離子通道結(jié)構(gòu)及功能的異常與特發(fā)性癲癇，特別是失神癲癇密切相關(guān)。本文對(duì)特發(fā)性癲癇動(dòng)物模型及不同人群中T型鈣離子通道的基因變異及其所導(dǎo)致的電生理變化進(jìn)行綜述，希望對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制的研究提供思路，并為特發(fā)性癲癇的治療提供依據(jù)。

1 電壓依賴性鈣通道的分類及結(jié)構(gòu)

電壓依賴性鈣通道（voltage-gated calcium channels，VGCCs）是Ca2+內(nèi)流的主要途徑，參與鈣離子的細(xì)胞內(nèi)興奮作用及多種鈣離子依賴過程,在癲癇發(fā)生機(jī)制中占有重要地位。VGCCs分為高電壓依賴性（high-voltage-activated，HVA）和低電壓依賴性（low-voltage-activated，LVA）鈣通道。HVA鈣通道由α1、β、α2δ、γ亞基構(gòu)成，其中α1為功能亞基，β、α2δ、γ為輔助亞基。LVA鈣通道僅由α1亞單位組成。依據(jù)生理學(xué)特性將VGCCs分為L-、N-、P-、Q-、R-、T-型鈣通道，其中T-型鈣通道是低電壓依賴性的。依據(jù)不同的α1亞基將VGCCs分為Cav1、Cav2、Cav3三個(gè)系列，其中，Cav3系列又包括Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3，均屬于T型鈣通道，分別由CACNA1G、CACNA1H、CACNA1I基因編碼。

2 T型鈣通道的生物學(xué)特性

T型鈣通道在接近靜息電位時(shí)很容易興奮和失活。由于T型鈣通道失活恢復(fù)時(shí)間緩慢，激活和失活相互重疊，使這些通道具有改變神經(jīng)元興奮性的能力。T型鈣離子通道的重要電生理特性：①T型鈣離子通道參與低域值鈣棘波（low threshold calcium spike，LTCS)的形成——由NMDA受體誘導(dǎo)的低幅度去極化可產(chǎn)生瀑布效應(yīng)，使大量T型鈣通道開放，形成LTCS[1],引發(fā)棘慢波（spike-and-wave discharges，SWDs）發(fā)放[2]；②T型鈣通道參與丘腦—皮層神經(jīng)元同步化震蕩——丘腦—皮層神經(jīng)元同步化震蕩生理情況下可在睡眠中出現(xiàn)，異常的超同步化放電與兒童失神癲癇（childhood absence epilepsy，CAE）密切相關(guān)[3]；③T型鈣通道可引發(fā)“窗口電流”——T型鈣通道激活及失活曲線重疊的膜電位下，可引發(fā)“窗口電流”，增加穩(wěn)態(tài)下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度[4]?？傊琓型鈣通道通過控制細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度及調(diào)控膜電位發(fā)揮生物學(xué)作用。

3 Cav3.1在癲癇中的作用

3.1 Cav3.1在癲癇動(dòng)物模型中的研究 丘腦表達(dá)3種T型鈣通道：α1G在丘腦中繼核大量表達(dá)，α1H、α1I主要在丘腦網(wǎng)狀核表達(dá)。在誘導(dǎo)基因缺陷大鼠模型及自發(fā)癲癇動(dòng)物模型均可觀察到癇性發(fā)作中的促放電[5]，尤其在丘腦網(wǎng)狀核及中繼核中可以檢測到高同步的促放電，腦電圖上表現(xiàn)為SWDs[6]。HVA的功能缺陷大鼠模型（α1A-/-）表現(xiàn)為失神發(fā)作，在其丘腦皮層中繼神經(jīng)元上可檢測到由Cav3.1介導(dǎo)的鈣電流增加[7]。腦電圖上可記錄到明顯的3HzSWDs，這與人類失神癲癇發(fā)作極為相似[8]。GABA受體激動(dòng)劑可誘發(fā)野生小鼠產(chǎn)生雙側(cè)3～4HzSWDs，但很難誘發(fā)CACNA1G基因敲除小鼠產(chǎn)生失神癲癇，推測丘腦缺乏CACNA1G表達(dá)時(shí)，可以特異性抵抗由GABA受體介導(dǎo)的SWDs發(fā)放。近期研究發(fā)現(xiàn)大鼠CACNA1G基因剪切突變體可以影響鈉離子通道變異所致癲癇的嚴(yán)重程度[9]。

T型鈣電流的上調(diào)是否是失神癲癇發(fā)作的關(guān)鍵？Sonq等[10]用α1A-/-鼠與α1G-/-鼠雜交，篩選3種不同基因型的小鼠：α1A-/-α1G-/-、α1A-/-α1G+/+、α1A-/-α 1G-/+；與野生型小鼠（α1A+/+α1G+/+）比較，α1A-/-α 1G+/+鼠丘腦中繼核鈣電流上調(diào)60%；α1A-/-α1G-/+鼠產(chǎn)生的T型鈣電流只有野生型的75%；α1A-/-α1G-/-沒有產(chǎn)生明顯T型鈣電流。推斷T型鈣電流的增加可能由于α1A基因的缺失引起，且受到α1G基因的影響。行腦電圖監(jiān)測發(fā)現(xiàn)：T型鈣電流減少的α1A-/-α1G-/+鼠記錄到明顯的SWDs，程度與T型鈣電流明顯上調(diào)的α1A-/-α1G+/+鼠相當(dāng)；α1A-/-α1G-/-鼠未記錄到SWDs。由此推斷丘腦T型鈣電流在產(chǎn)生SWDs是不可缺少的[11]。Ernst等[12]建立了兩系BAC轉(zhuǎn)基因小鼠（α1G-Tg1低拷貝組和α1G-Tg2高拷貝組）均過度表達(dá)α1G鈣通道并可記錄到規(guī)律的SWDs。與非轉(zhuǎn)基因小鼠比較，BAC鼠腦內(nèi)CACNA1G mRNA及蛋白表達(dá)相應(yīng)增高，丘腦中繼核神經(jīng)元T型電流密度持續(xù)增加；α1GTg2較α1G-Tg1組mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增高。該實(shí)驗(yàn)首次表明：α1G鈣通道的增加足夠引起棘波振蕩，誘發(fā)失神癲癇。

相反的，在WAG/Rij癲癇鼠模型中應(yīng)用選擇性T型鈣通道阻滯劑可以有效控制癲癇發(fā)作[13]。在活體應(yīng)用乙琥胺及阻斷T型鈣通道可以明顯減少丘腦皮質(zhì)環(huán)路的振蕩。近期研究新鈣通道拮抗劑Z941和Z944可以高選擇性結(jié)合T型鈣離子通道，可以顯著抑制失神癲癇發(fā)作[14]。以上實(shí)驗(yàn)表明Cav3.1基因缺失不能誘發(fā)癲癇，Cav3.1基因敲除甚至可以起到“治療”癲癇的作用。Cav3.1過度上調(diào)是失神癲癇產(chǎn)生的重要原因，可以獨(dú)立誘發(fā)小鼠失神發(fā)作，但T型鈣電流的上調(diào)不是引發(fā)失神癲癇發(fā)生的必要條件。

3.2 Cav3.1在癲癇人群中的研究 在漢族人群中，CACNA1G變體與CEA的相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果未見陽性報(bào)道。Singh等[15]分析了123例日本及西班牙的特發(fā)性癲癇患者，并與360名健康個(gè)體進(jìn)行對(duì)照。發(fā)現(xiàn)13個(gè)突變體，其中5個(gè)包括氨基酸替換。c.1709C＞T（Ala570Val）主要在青少年肌陣攣性癲癇（juvenile myoclonic epilepsy，JME）及早期CEA患者中零散出現(xiàn)，且對(duì)照組中沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)變體。c.3265G＞T(Ala1089Ser)在3個(gè)JME家系中出現(xiàn)，并在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)1個(gè)相應(yīng)變體。c.2968G＞A在2例JME患者及3名對(duì)照個(gè)體中出現(xiàn)。目前認(rèn)為CACNA1G是特發(fā)性癲癇的一個(gè)潛在易感基因。

4 Cav3.2在癲癇中的作用

4.1 Cav3.2在癲癇動(dòng)物模型中的研究 T型鈣通道基因CAC?NA1H編碼Cav3.2。Strasbourg大鼠癲癇失神發(fā)作模型與對(duì)照組相比T型電流上調(diào)55%，Cav3.2mRNA增加16%[16]。匹羅卡品致癇大鼠在長期癲癇發(fā)作后，其海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞上可檢測到Cav3.2表達(dá)上調(diào)及T型鈣電流的增加[17]。Graef等[18]對(duì)該模型丘腦中線核內(nèi)T型鈣通道的改變進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在癲癇持續(xù)狀態(tài)時(shí)丘腦內(nèi)T型鈣離子通道的基因表達(dá)改變不明顯，但在發(fā)作后10天及31天時(shí)Cav3.2 mRNA明顯增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)癇性發(fā)作并不能誘導(dǎo)CaV3.2基因敲除鼠的T型鈣電流及促放電增加，且CaV3.2基因敲除鼠海馬CA1及CA3區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞損傷較自發(fā)癲癇大鼠減輕[19]。引起鈣電流增加導(dǎo)致邊緣系統(tǒng)同步化放電的原因并不十分清楚，推測可能是由于T型鈣電流上調(diào)誘導(dǎo)的促放電活動(dòng)加強(qiáng)邊緣系統(tǒng)的同步化震蕩，從而誘發(fā)邊緣葉癲癇。

在自發(fā)性反復(fù)多次癲癇發(fā)作中，T型鈣通道的電流強(qiáng)度增加。丘腦神經(jīng)元的突然放電表現(xiàn)為全細(xì)胞電流的增強(qiáng)，推斷癲癇持續(xù)狀態(tài)可誘發(fā)丘腦中線核神經(jīng)元離子通道的重建，這可解釋自發(fā)性癲癇反復(fù)多次發(fā)作中神經(jīng)元興奮性增高的特征性變化[20]。

4.2 Cav3.2在兒童失神癲癇中的研究 在CAE患兒中，共發(fā)現(xiàn)有68個(gè)CACNA1H基因核甘酸多態(tài)，其中29個(gè)只在CAE患兒中出現(xiàn)。在這29個(gè)位點(diǎn)中包含12個(gè)不同的錯(cuò)義突 變（F161L、C456S、G499S、P648L、R744Q、A748V、G773D、G784S、R788C、V831M、D1463N），隨后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CACNAlH基因3個(gè)新的錯(cuò)義突變位點(diǎn)（H515Y、P314S、P492S）。其中3例有G773D的患者在同一等位基因均含有R788C。CAE患兒CACNAlH基因變異可以誘導(dǎo)神經(jīng)元超興奮，失活向反超極方向移動(dòng)，激活向超極化方向移動(dòng)，單通道電導(dǎo)增加，通道開放速率增加，通道失活速率及通道從失活的恢復(fù)過程減慢[21]，進(jìn)一步提示CACNA1H是CEA的重要易感基因。其它研究表明CACNA1H的突變體與顳葉癲癇、青少年肌陣攣癲癇、家族性遺傳性癲癇綜合征、孤獨(dú)癥譜系障礙等有關(guān)[22]。

4.3 CaV3.2 I-II loop在癲癇中的作用 在一些特發(fā)性癲癇的患者中可以發(fā)現(xiàn)Cav3.2的變體，連接Cav3.2Ⅰ、Ⅱ結(jié)構(gòu)域的環(huán)（loop）結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而誘導(dǎo)Cav3.2在細(xì)胞膜上的表達(dá)增加。CaV3.2 I-II loop有兩個(gè)不同的功能區(qū)，最接近IS6和IIS1跨膜片段的基序調(diào)節(jié)門控，中間基序調(diào)節(jié)CaV3.2通道的表達(dá)。研究表明該區(qū)域缺失可導(dǎo)致CaV3.2表達(dá)增加3倍[23]。IS6后的62個(gè)氨基酸(a.a.429–491)不僅調(diào)節(jié)門控，而且加速通道的激活和失活。CAE患者編碼III loop的基因序列發(fā)生改變，導(dǎo)致Cav3.2的表達(dá)增加,引發(fā)失神癲癇[24]。共聚焦顯微鏡下可觀察到：該Cav3.2變體在細(xì)胞膜系統(tǒng)鈣離子通道表達(dá)均增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，進(jìn)一步影響轉(zhuǎn)錄及翻譯。

4.4 CaV3.2在顳葉癲癇中的作用

在顳葉癲癇中，海馬CA1區(qū)T型電流上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，匹羅卡品致癇大鼠模型CA1區(qū)神經(jīng)元更有自發(fā)放電的傾向。最近利用Cav3.2（-/-）小鼠模型人為建立Cav3.2，觀察Cav3.2在癲癇發(fā)生中的作用[25]，發(fā)現(xiàn)在顳葉癲癇模型中CA1區(qū)神經(jīng)元的突觸傳入量改變，在依靠海馬直接聯(lián)系通路的嗅皮層，突觸傳入量明顯增加，并且在電點(diǎn)燃海馬區(qū)T型電流增加。目前認(rèn)為海馬CA1區(qū)Cav3.2的上調(diào)是導(dǎo)致遠(yuǎn)端樹突興奮性突觸后電位增強(qiáng)的原因[26]。顳葉癲癇與神經(jīng)元內(nèi)T型電流的上調(diào)有關(guān)。

5 結(jié)語

綜上，在動(dòng)物模型及癲癇患者中均可發(fā)現(xiàn)T型鈣離子通道基因CACNA1G、CACNA1H的變異，鈣離子通道的改變促使丘腦皮質(zhì)及邊緣系統(tǒng)的鈣電流增加，使神經(jīng)細(xì)胞興奮性改變，增加癲癇易感性。在人群中T型鈣離子通道基因變異的研究還很局限，新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)不多，而且還需在不同的人群中大樣本驗(yàn)證，有些“陰性”位點(diǎn)在其它人群中可能為“陽性”位點(diǎn)。特發(fā)性癲癇是一種多基因遺傳病[28]，目前研究主要集中在點(diǎn)突變。為闡明鈣離子通道在癲癇中的發(fā)病機(jī)制，需要采用多種技術(shù)綜合研究，如采用新一代測序技術(shù)，外顯子測序、基因拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV），比較基因組雜交（comparative ge?nomic hybridization，CGH）以及表觀遺傳修飾等方法。

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