兔VX2口腔鱗狀細胞癌模型的研究進展＊

張 林(綜述)，黃桂林(審校)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴州遵義 563099)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是危害人類健康的常見惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5%?？谇击[癌中34%為舌癌、30%為口底癌、頰粘膜癌與牙齦癌各為16%和11%［1］，常伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，晚期可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。因此，建立用于研究的口腔鱗癌動物模型是十分必要的。常用實驗動物有裸鼠、小鼠、大鼠和兔;方法包括化學(xué)藥物誘導(dǎo)法、移植瘤法、轉(zhuǎn)基因法等。其中利用VX2腫瘤細胞制作的兔口腔鱗狀細胞癌模型具有操作簡單易行、可重復(fù)性好、瘤體存活率高和建模時間短等優(yōu)點。且其侵襲、血道、淋巴管轉(zhuǎn)移方式與人類口腔頜面部癌相似［2］。因此，它對人類口腔癌的研究具有十分重要的意義，是現(xiàn)在常用的口腔癌動物研究模型。

1 VX2腫瘤的來源及歷史

1933年Shope和Hurst［3］發(fā)現(xiàn)了在家兔皮膚上自然發(fā)生的由病毒引起的乳頭狀瘤，將該病毒命名為Shope乳頭狀瘤病毒，并且通過這些乳頭狀瘤惡變，可形成鱗狀細胞癌。1936年 Kidd［4］將 Shope病毒的提取物接種到劃破的兔皮膚斑點上，約10個月后成功誘發(fā)了鱗癌。隨后Kidd在1936年以“V1”命名第一代該腫瘤細胞并報道移植成功，但是V1腫瘤在二次傳代中停止生長。V1腫瘤在實驗過程中，還導(dǎo)致了“V2”鱗癌細胞系的出現(xiàn)。最初V2鱗癌細胞接種在荷蘭條紋兔上只有5%的成瘤率。第三代“V2”細胞成瘤率提高到21%。關(guān)于移植成功的報道一直持續(xù)到第十四代，V2鱗癌細胞可快速在接種動物的體內(nèi)生長。在傳代接種的過程中，V2細胞越來越向未分化的方向發(fā)展，其惡性程度不斷提高，不僅可在兔類成瘤，還可接種于小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠等動物。最后經(jīng)72次傳代后鱗癌細胞性質(zhì)穩(wěn)定，在1940年統(tǒng)一命名為“VX2”細胞株。1952年Kidd等報道新西蘭種屬兔缺乏針對VX2鱗癌細胞的抗體，并確定為穩(wěn)定的可移植細胞株。

2 VX2鱗癌細胞的培養(yǎng)及特征

無菌操作下摘取荷瘤兔VX2腫瘤邊緣增殖活躍的部分瘤體，按一般動物細胞培養(yǎng)方法［5］，可用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液對腫瘤組織進行原代培養(yǎng)。蘇暢等［6］通過對VX2細胞進行離體培養(yǎng)，用最初純化的細胞在相差顯微鏡下觀察，可見到扇形的細胞質(zhì)，經(jīng)一段時間傳代后細胞呈單層貼壁生長的上皮樣細胞排列，生長成團后即出現(xiàn)重疊生長現(xiàn)象，細胞以長三角形、多邊形為主。HE染色見VX2細胞為輕度嗜堿性，核大且核質(zhì)比例異常，細胞異型性明顯，核分裂象多見。劉險峰等［7］取第55、56代細胞培養(yǎng)后測定其生長特性，發(fā)現(xiàn)用1.5×105個/瓶細胞濃度進行接種，到第3天達到高峰。VX2細胞的分裂指數(shù)為8.49%，細胞倍增時間為34.5 h。流式細胞儀進行細胞周期分析，結(jié)果為:G1期占69.3%，G2 期占5.6%，S 期占25.1%。

3 VX2腫瘤細胞的凍存與復(fù)蘇

為防止反復(fù)接種導(dǎo)致的腫瘤污染和避免腫瘤惡性程度降低，可對VX2細胞或瘤塊進行凍存。將100 mL/L胎牛血清和80 g/L的二甲基亞砜加入RPMI1640培養(yǎng)液中配制成凍存液，取對數(shù)生長期細胞和凍存液混勻后放入液氮罐中保存。凍存細胞復(fù)蘇后置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，VX2細胞成活率可大于 80%［8］。

從瘤兔身上取出的VX2瘤塊經(jīng)過清洗、剪碎及離心后，按沉淀物體積1∶1加入凍存保護劑(體積百分比為二甲亞砜:胎牛血清:RPMI1640培養(yǎng)液=20∶8∶72)［9］，通過梯度降溫可凍存于液氮中。采用該方法冷凍6個月復(fù)蘇后的瘤塊與新鮮瘤塊接種制作荷瘤兔的成瘤率和生長方式無明顯差異［10］。

4 荷瘤兔的制作方法

VX2腫瘤細胞可通過植入一個1～3 mm3大小瘤塊或者1mL培養(yǎng)的細胞懸液(107～109個/mL)到兔的后腿外側(cè)肌肉、腹部、腹股溝區(qū)及頸后皮下等處制成荷瘤兔［11］。瘤塊與細胞懸液相比，致瘤率和腫瘤生長速度都有提高［12］。瘤塊植入后腿肌肉內(nèi)的成瘤率較高，可達90% ～100%［13］。

瘤塊制作荷瘤兔方法如下:在無菌操作下取出VX2瘤兔腫瘤，清洗后把魚肉樣新鮮組織浸泡在4℃生理鹽水或者RPMI1640培養(yǎng)液中，用手術(shù)刀片和剪刀將瘤塊剪切成1～3 mm3大小瘤塊備用。兔麻醉后取俯臥位，后腿外側(cè)除毛備皮，固定四肢，常規(guī)術(shù)區(qū)消毒鋪巾，捫及后腿外側(cè)肌肉豐富區(qū)，作一長約1cm左右切口，切開皮膚、皮下及筋膜組織，鈍性分離肌肉形成一深約0.5～1 cm的小腔隙，并需有血流出，用眼科鑷夾持2～3個瘤塊植入，棉球壓迫止血后分層縫合創(chuàng)口。術(shù)后可予普魯卡因青霉素22 000 U/kg連續(xù)抗炎治療3 d。2周左右可在兔后腿肌肉接種區(qū)捫及一直徑約1～2 cm的實性腫塊，即荷瘤兔制作成功。接種后3～4周瘤體直徑可達2～4 cm，此時腫瘤細胞生長旺盛且壞死組織少，最適宜取出腫瘤進行細胞傳代培養(yǎng)或用瘤塊制作下一批荷瘤兔［14］。隨著時間推移，瘤體越長越大，4周后其表面皮膚可出現(xiàn)破潰，切開瘤體見內(nèi)部有明顯的液化壞死，荷瘤兔的生存時間一般為6周左右。

5 兔口腔內(nèi)不同部位的鱗癌模型制作及研究

VX2腫瘤常用于建立兔頰部和舌部的口腔鱗癌動物模型。頰部鱗癌模型的制作方法分為2種，即口外接種法和口內(nèi)接種法?？谕饨臃N法是兔麻醉后取俯臥位，固定后在兔口外面頰部行常規(guī)術(shù)區(qū)備皮消毒后，于咬肌區(qū)作一5～10 mm大小切口切開皮膚，分離皮膚、皮下組織和筋膜，直至顯露頰肌，取3～4粒備用瘤塊植入頰肌內(nèi)，并使肌肉內(nèi)有少量出血，用棉球壓迫止血后分層縫合。口內(nèi)接種法是將兔取仰臥位，固定四肢，用繃帶牽拉上下頜前牙，使兔大開口，在口腔內(nèi)頰黏膜咬頜線上下常規(guī)術(shù)區(qū)消毒后，作一長約3～5 mm的縱行切口，分離顯露頰肌，將3～4粒備用瘤塊植入到頰肌中，同樣植入時使肌肉少量出血，創(chuàng)口局部止血后嚴密縫合以保證瘤塊不會溢出。2～3周后，接種瘤塊的兔頰部均可捫及直徑約1～3 cm大小的瘤體，表明兔頰部VX2鱗癌模型成功建立。

童樹友等［15］采用口外法和口內(nèi)法制作頰癌模型對比，口外法15只兔成瘤率為100%，口內(nèi)法15只兔因頰部瘤體向口內(nèi)突出，容易因摩擦導(dǎo)致破潰和出血，并影響動物進食和呼吸，有4只兔死亡。VX2腫瘤植入后的第2周，瘤兔一般狀況可，第3～5周出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退、體重減輕、毛色暗淡、輕度腹瀉等癥狀，并呈進行性加重，在6周左右瘤兔全部死亡。Li－Min Lin［16］等在8只新西蘭大白兔左頰部植入VX2瘤塊，6周后發(fā)現(xiàn)腫瘤破潰外露，沒有發(fā)現(xiàn)有遠處臟器轉(zhuǎn)移，但是其中4只兔子一共有11個頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，平均每只兔有2.75個轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，還有1只兔的下頜骨被腫瘤組織侵犯。朱坤鷗等［17］采用激光和5－Fu緩釋劑聯(lián)合對兔頰部VX2鱗癌的作用研究，證實用藥前3周靜脈推注5－Fu組比頰部植入5－Fu緩釋劑對腫瘤體積的抑制效果強，但第3周后緩釋劑組對腫瘤的抑制要明顯大于靜脈給藥組，而5－Fu緩釋劑在激光的配合下對腫瘤的抑制作用更加明顯，其他各組與聯(lián)合治療組比較有顯著差異。

兔舌部的鱗癌模型可根據(jù)舌的不同部位進行制作，方法類似于口內(nèi)頰部腫瘤模型的建立，是切開兔舌部黏膜后植入1～2個瘤塊，縫合創(chuàng)口，術(shù)后1周即可觀察到舌部潰爛和瘤體形成。Jefferis AF等［18］第一次報道成功制作了兔舌部VX2鱗癌模型，其生物學(xué)和病理學(xué)上是最為接近人舌癌的大型動物模型。沈毅等［19］將舌分為舌前1/3舌緣、舌前1/3中線、舌中1/3舌緣和舌中1/3中線4區(qū)分別建立舌癌模型，并觀察其頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)成瘤兔最早第3周可發(fā)現(xiàn)有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，總轉(zhuǎn)移率達70%，而4個分區(qū)的舌癌導(dǎo)致頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異情況無統(tǒng)計學(xué)意義，兔的生存期為4～6周。Seki S等［20］通過抗血管生成劑TNP－470對舌癌瘤兔進行耳緣靜脈給藥，發(fā)現(xiàn)該藥可明顯抑制腫瘤生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNP－470處理組毛細淋巴管的平均數(shù)量顯著少于對照組，收集的淋巴管平均直徑明顯小于對照組。

6 展望

兔VX2鱗癌的生長、轉(zhuǎn)移和侵襲等生物學(xué)行為依賴于移植的位置，和人類自然發(fā)生的口腔癌有一定的區(qū)別，且其在傳代過程中個別腫瘤可能會出現(xiàn)自發(fā)性衰退，導(dǎo)致成瘤率隨傳代次數(shù)增多而下降。但是VX2鱗癌細胞制作的兔口腔癌模型，其腫瘤生長、淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移方式均和人類口腔癌相似［21］，比小型動物模型有易于操作、成瘤率高和動物生存期較長等明顯優(yōu)勢，是目前最理想的大型口腔癌動物模型［22］?，F(xiàn)在國內(nèi)外對兔VX2口腔癌模型的基礎(chǔ)和臨床研究相對較少，未來可對VX2鱗癌細胞的成瘤原理、轉(zhuǎn)移機制、免疫逃逸現(xiàn)象以及各種臨床治療方法等行進一步探索，特別是臨床上最佳化療方案的選擇、對頭頸部轉(zhuǎn)移癌的放化療結(jié)合治療以及在口腔腫瘤治療中應(yīng)用新抗癌緩釋藥物的系列研究，將為口腔癌治療方法的相關(guān)理論提供有力的支持依據(jù)。

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