制備誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分子系統(tǒng)

劉瀏，馬晴雯

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）在形態(tài)學(xué)特征、表面抗原、基因表達(dá)模式及表觀遺傳狀態(tài)等方面與胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）類(lèi)似[1-4]，注射裸鼠后也同樣可以在體內(nèi)形成含有 3 個(gè)胚層的畸胎 瘤[1,4]，甚至能像 ESCs 一樣通過(guò)四倍體補(bǔ)償技術(shù)獲得具有生殖能力的活體小鼠[5-6]。在實(shí)際應(yīng)用中，iPSCs 可避免 ESCs 的諸多弊端，如倫理問(wèn)題、胚胎來(lái)源的選擇、安全性問(wèn)題等，因此，越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道了 iPSCs 在再生醫(yī)學(xué)、疾病模型的建立、細(xì)胞及基因治療、藥物的發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)等方面的研究和應(yīng)用[7-10]。

成功獲得 iPSCs 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是將外源性的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入到要誘導(dǎo)的體細(xì)胞中，并使之高效重編程。這些外源性因子可以是最初的 Yamanaka 四因子：Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4[1]，或 Thomson 四因子：Oct4、Sox2、Nanog 和 Lin28[11]，也可以是其他轉(zhuǎn)錄因子的組合，例如，3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子：Oct4，Sox2 和 Klf4，即四因子中除去了 c-Myc，但是重編程效率降低了許多[12]；兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 Oct4 和 Sox2 與小分子化合物丙戊酸（VPA）聯(lián)合使用也可產(chǎn)生 iPSCs[13-14]；另外，在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中，因其內(nèi)源性高表達(dá) Sox2 和 c-Myc，使用兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子 Oct4 和 Klf4 即可誘導(dǎo)其成為 iPSCs[15]，甚至單獨(dú)使用轉(zhuǎn)錄因子 Oct4 也可得到 iPSCs[16]。本文總結(jié)了制備 iPSCs 的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、蛋白誘導(dǎo)系統(tǒng)和 RNA 相關(guān)誘導(dǎo)方法的優(yōu)勢(shì)和限制因素。

1 基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

1.1 病毒載體

1.1.1 整合型 用于獲得 iPSCs 的整合型病毒載體主要有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（retroviral vectors，RV）和慢病毒載體（lentiviral vector，LV）兩種，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種 RNA 病毒，不能自主復(fù)制，但是可以通過(guò)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，使病毒基因組的 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 DNA，并隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，隨宿主 DNA 一同進(jìn)行復(fù)制，因此其只能感染處于分裂期的細(xì)胞。Yamanaka 等第一次成功得到 iPSCs 就是應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 4 種轉(zhuǎn)錄因子整合入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和尾尖成纖維細(xì)胞的基因組[1]。慢病毒載體屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一個(gè)亞類(lèi)，其既可感染分裂期細(xì)胞又可感染非分裂期細(xì)胞[17]，研究發(fā)現(xiàn)慢病毒載體對(duì)于易引發(fā)腫瘤的整合位點(diǎn)的易感性比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低[18]。Yu 等[3]分別將 4 種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Nanog 和 Lin28）連入慢病毒載體，將人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為 iPSCs。

但上述方法需要感染多個(gè)病毒載體，增加了基因突變率和基因組的不穩(wěn)定性。隨后科學(xué)家們成功地利用一個(gè)多順?lè)醋勇《据d體得到了 iPSCs，即 4 種轉(zhuǎn)錄因子在同一個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）內(nèi)，不需多個(gè)病毒載體同時(shí)感染，插入突變率相對(duì)降低，重編程效率也相對(duì)提 高[19-22]。但這類(lèi)整合型病毒載體依然存在嚴(yán)重的安全隱患，如插入突變等，且插入的轉(zhuǎn)錄因子如 c-Myc[4,23]和 Klf4[24]有致癌作用，可導(dǎo)致腫瘤的形成。另外，即使很低的病毒載體表達(dá)水平都有可能改變 iPSCs 的分化潛能或?qū)е聬盒赞D(zhuǎn)化[25-26]，殘余轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)也會(huì)影響 iPSCs 的分子特征[27]。因此，如何獲得無(wú)轉(zhuǎn)錄因子、無(wú)載體的 iPSCs（transgene and vector-free iPS cells）是制備 iPSCs 研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方面。

將 Cre/loxP 重組系統(tǒng)與病毒載體系統(tǒng)聯(lián)合使用，使其成為一個(gè)可切除的整合型病毒載體，可作為制備無(wú)外源轉(zhuǎn) 錄因子的 iPSCs 的理想系統(tǒng)。Soldner 等[27]利用含有 Cre/loxP 重組系統(tǒng)的病毒載體成功地將人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為無(wú)外源轉(zhuǎn)錄因子的 iPSCs。Cre/loxP 重組系統(tǒng)包括 Cre 重組酶和 loxP 位點(diǎn)兩部分[28-29]，來(lái)源于大腸桿菌 Pl 噬菌體的 Cre 重組酶是一個(gè)位點(diǎn)特異性的 DNA 重組蛋白[30]，它能催化兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的重組反應(yīng)。Soldner 等在含有轉(zhuǎn)錄因子的病毒載體的 3' 長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminal repeat，LTR）加入 loxP 序列，這樣的病毒載體轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)復(fù)制在 5'LTR 也形成了一個(gè) loxP 位點(diǎn)。因此，整合發(fā)生后轉(zhuǎn)錄因子基因兩側(cè)就各含有一個(gè) loxP 位點(diǎn)。在瞬時(shí)表達(dá) Cre 重組酶的情況下，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子基因的切除。這樣就得到了無(wú)外源轉(zhuǎn)錄因子的 iPSCs[27]。通過(guò)全基因組轉(zhuǎn)錄水平分析，這種轉(zhuǎn)錄因子被切除的 iPSCs 與傳統(tǒng)的不切除轉(zhuǎn)錄因子的 iPSCs 相比，更接近人的胚胎干細(xì)胞[27]。

1.1.2 非整合型 腺病毒載體屬于非整合型病毒載體，無(wú)論宿主細(xì)胞處于分裂期還是非分裂期，均可高效轉(zhuǎn)染[31-32]，其轉(zhuǎn)染方式為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，幾乎不整合入宿主細(xì)胞的基因組中，因此大大降低了發(fā)生插入突變的風(fēng)險(xiǎn)。Stadtfeld 等[33]以腺病毒載體作為轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將小鼠的成纖維細(xì)胞和肝臟細(xì)胞誘導(dǎo)成為 iPSCs。但是用腺病毒載體得到的 iPSCs 的重編程效率很低，可以通過(guò)加入一些化學(xué)小分子的 方法來(lái)提高細(xì)胞的重編程效率[34]。

1.2 非病毒載體

1.2.1 非整合型 Okita 等[35]利用質(zhì)粒載體作為轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)成功地將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為 iPSCs。實(shí)驗(yàn)中反復(fù)轉(zhuǎn)染了兩種表達(dá)質(zhì)粒，一種質(zhì)粒包含有 Oct4、Sox2 和 Klf4 3 種轉(zhuǎn)錄因子的互補(bǔ) DNA（cDNA）；另一種質(zhì)粒包含有 c-Myc 的 cDNA。利用傳統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法雖然能夠得到 iPSCs，但是效率極低，從而在一定程度上阻礙了其臨床試驗(yàn)應(yīng)用。

Jia 等[36]使用 minicircle DNA 作為基因轉(zhuǎn)移的載體，成功地將人脂肪干細(xì)胞（human adipose stem cells，hASCs）和成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成了 iPSCs，且轉(zhuǎn)染 minicircle DNA 后對(duì) hASCs 內(nèi)的 RNA 進(jìn)行的定量 PCR 和光學(xué)計(jì)數(shù)分析證實(shí) minicircle DNA 作為載體時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平明顯高于普通質(zhì)粒載體。Minicircle DNA 是一種超螺旋的 DNA 分子，它是親本質(zhì)粒（parental plasmid，PP）發(fā)生自身位點(diǎn)特異性重組的產(chǎn)物。與傳統(tǒng)質(zhì)粒載體相比，minicircle DNA 作為載體去除了細(xì)菌骨架的絕大部分基因序列，如復(fù)制起始位點(diǎn)和抗性基因等，并且其序列大小與傳統(tǒng)質(zhì)粒載體相比明顯小了很多，因此 minicircle DNA 作為基因轉(zhuǎn)移的載體具有安全性好、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平高等優(yōu) 點(diǎn)[37-39]，可以作為獲得 iPSCs 的理想載體。

另外，Yu 等[40]利用 oriP/EBNA1 載體通過(guò)一次轉(zhuǎn)染即成功地將人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成為 iPSCs，此后這種質(zhì)粒載體在無(wú)藥物篩選的條件下從細(xì)胞中消失，從而得到無(wú)轉(zhuǎn)錄因子、無(wú)載體的 iPSCs。oriP/EBNA1 載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體外的穩(wěn)定復(fù)制僅需要一個(gè)順式作用元件 oriP 和一個(gè)反式作用因子 EBNA1 的參與。這種非整合型載體避免了傳統(tǒng)整合型病毒載體的缺點(diǎn)，同時(shí)證明外源重編程因子不需要整合到細(xì)胞基因組，也不需要持續(xù)表達(dá)，即可獲得 iPSCs，為 iPSCs 應(yīng)用于臨床試驗(yàn)掃除了一個(gè)障礙，但與其他非整合型載體一樣，該系統(tǒng)重編程效率極低。

1.2.2 整合型 piggyback（PB）轉(zhuǎn)座子不受宿主細(xì)胞的制約，且已被證實(shí)在包括人和小鼠在內(nèi)的多種細(xì)胞系中發(fā)揮作用。PB 轉(zhuǎn)座子（轉(zhuǎn)座酶）系統(tǒng)作為生產(chǎn) iPSCs 的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)時(shí)，需要兩個(gè)表達(dá)載體，即轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)載體。將這兩種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)座酶的作用下，轉(zhuǎn)座子的表達(dá)載體將 4 種轉(zhuǎn)錄因子整合入要誘導(dǎo)的體細(xì)胞基因組中獲得 iPSCs。隨后在 iPSCs 中再瞬時(shí)轉(zhuǎn)染適量轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體，其表達(dá)的轉(zhuǎn)座酶可使轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體在基因組插入位點(diǎn)處發(fā)生無(wú)縫切除，從而獲得更安全的無(wú)轉(zhuǎn)錄因子、無(wú)載體的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[41-42]。Wohjen 等[41]就是通過(guò)這種 PB 轉(zhuǎn)座子（轉(zhuǎn)座酶）系統(tǒng)將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入細(xì)胞中，成功地將小鼠和人胚胎樣成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為無(wú)轉(zhuǎn)錄因子、無(wú)載體的 iPSCs，安全性大大提高。但是 PB 轉(zhuǎn)座子的無(wú)縫切除作用不夠精確[43]，于是，Guo 等[44]聯(lián)合使用 PB 轉(zhuǎn)座子與 Cre/loxP 重組系統(tǒng)，在 Cre/loxP 重組系統(tǒng)的切除作用下，成功地將小鼠外胚層干細(xì)胞（epistem cell，EpiSC）誘 導(dǎo)成為無(wú)轉(zhuǎn)錄因子、無(wú)載體的 iPSCs。

另外，Ye 等[45]利用噬菌體 ΦC31 整合酶系統(tǒng)成功地將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、人羊水細(xì)胞誘導(dǎo)為 iPSCs。ΦC31 整合酶屬于位點(diǎn)特異性的絲氨酸重組酶類(lèi)，可催化細(xì)菌附著位點(diǎn)（bacterial attachment site，attB）和噬菌體附著位點(diǎn)（phage attachment site，attP）發(fā)生重組并生成 attL 和 attR 序列。真核細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染含有 attB 的質(zhì)粒后，在 ΦC31 整合酶的催化作用下同樣可以發(fā)生位點(diǎn)特異性的重組反應(yīng)，基因組中的重組位點(diǎn)與野生 attP 位點(diǎn)具有序列相似性，被稱(chēng)為假 attP 位點(diǎn)[46-47]。ΦC31 整合酶介導(dǎo)的整合反應(yīng)傾向于將外源基因整合到基因間區(qū)域，這就使得靶細(xì)胞基因組被破壞的風(fēng)險(xiǎn)明顯低于隨機(jī)整合[45,48]。為了獲得無(wú)轉(zhuǎn)錄因子的 iPSCs，Karow 等[49]將 ΦC31 整合酶與 Cre/loxP 重組系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用。ΦC31 整合酶將轉(zhuǎn)錄因子整合入宿主基因組中，誘導(dǎo)產(chǎn)生 iPSCs 之后，通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染表達(dá) Cre 重組酶的質(zhì)粒，在 Cre/loxP 重組系統(tǒng)的作用下將整合的轉(zhuǎn)錄因子從基因組中刪除，成功地將小鼠成纖維細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)為無(wú)轉(zhuǎn)錄因子的 iPSCs。

2 蛋白誘導(dǎo)系統(tǒng)

2.1 細(xì)胞穿透肽

細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptide，CPP）是一種可以與化合物或蛋白質(zhì)結(jié)合并轉(zhuǎn)導(dǎo)它們跨越細(xì)胞膜的載體[50]。多聚精氨酸肽由 6 ～ 12 個(gè)精氨酸殘基組成，其中由 11 個(gè)精氨酸殘基組成的 CPP（11R）的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力最強(qiáng)[51]。Zhou 和 Kim 等均成功利用多聚精氨酸肽融合的四因子獲得了蛋白誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（protein-induced pluripotent stem cells，piPSCs）[52-53]。Zhou 等[52]結(jié)合使用化學(xué)小分子丙戊酸，直接將誘導(dǎo)細(xì)胞重編程的四因子 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 以 11R-C 端融合蛋白的形式導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞中，第一次成功獲得蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的 iPSCs。同年，Kim 等[53]將 9R 融合的 4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白導(dǎo)入人成纖維細(xì)胞中，第一次成功獲得蛋白誘導(dǎo)的人 iPSCs。

2.2 人類(lèi)免疫缺陷病毒反式激活肽

人類(lèi)免疫缺陷病毒反式激活肽（HIV-TAT）能夠高效并且快速地轉(zhuǎn)導(dǎo)多種蛋白質(zhì)跨膜，其功能結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是一個(gè)由 47 ～ 57 個(gè)氨基酸殘基組成的富含酸性氨基酸的區(qū)域，這部分 TAT 被稱(chēng)為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（protein transduction domain，PTD）[54]。

Zhang 等[55]利用 TAT-重編程融合蛋白（TAT-RFs）成功誘導(dǎo)人包皮成纖維細(xì)胞（human foreskin fibroblast，HFF）為 iPSCs，且使用 5 種 TAT-RFs（Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog）要比使用 4 種 TAT-RFs（Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4）更容易獲得 iPSCs。另外，還發(fā)現(xiàn) TAT 和 11R 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率幾乎都為 100%，但就初始重編程效率而言，TAT-RFs 要明顯優(yōu)于 11R-RFs。

這種蛋白誘導(dǎo)的重編程方法不需要基因載體系統(tǒng)的參與，對(duì)宿主細(xì)胞基因組 DNA 不會(huì)產(chǎn)生任何的影響，但目 前只有 11R、9R 和 TAT 這 3 種蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)載體被成功應(yīng)用獲得 piPSCs，該技術(shù)仍然處于早期發(fā)展階段。其最大的缺點(diǎn)是重編程效率非常低，與一些質(zhì)粒載體及游離型載體幾乎相同，比整合型病毒載體或轉(zhuǎn)座子載體低 1000 倍[56]。不過(guò)，Li 等[57]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng) TAT 復(fù)合陽(yáng)離子脂質(zhì)體（Lipo-Tat）使用時(shí)，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可顯著增加 1000 倍。另外，Hitsuda 等[58]發(fā)現(xiàn) 3 個(gè)精氨酸殘基（3R-p53）結(jié)合吡啶（pyrenebutyrate）使用時(shí)，p53 的活性較 11R-p53 高，是一種高效的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。然而，到目前為止，上述這些最新研究的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體還未成功地應(yīng)用于制備 piPSCs 的研究中，仍需要更嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)去證明這些蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)載體是否能夠更有效地激活重編程過(guò)程。

3 RNA 相關(guān)的誘導(dǎo)方法

piPSCs 為科學(xué)家們獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞提供了新思路，但因蛋白直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞效率低、蛋白純化操作難度大、重編程效率低等問(wèn)題，RNA 相關(guān)的誘導(dǎo)方法被許多科學(xué)家們所重視。仙臺(tái)病毒（sendai virus）是一種 RNA 病毒，不會(huì)插入基因組，重編程效率相對(duì)較高，有不少科學(xué)家利用其為載體成功制備 iPSCs[59-61]，但其畢竟是病毒載體，安全隱患不能排除。2010 年，Warren 等[62]將誘導(dǎo)細(xì)胞重編程的轉(zhuǎn)錄因子以 mRNA 形式導(dǎo)入人成纖維細(xì)胞，成功獲得核糖核酸誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（RNA-induced pluripotent stem cells，RiPSCs），且 mRNA 誘導(dǎo)系統(tǒng)獲得 iPSCs 的效率是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的 36 倍，重編程速度是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的 2 倍。

2011 年，Anokye-Danso 等[63]利用 miR302/367 簇誘導(dǎo)小鼠和人的成纖維細(xì)胞生成了 iPSCs，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)方法（包括上述 Warren 等的 mRNA 誘導(dǎo)方法）相比，其重編程效率大大提高。他們分析 miRNAs 之所以能誘導(dǎo)獲得 iPSCs，可能與激活 Oct4 并抑制 HDAC2（組蛋白脫乙?；福┑幕钚杂嘘P(guān)。但是該方法用的是慢病毒載體轉(zhuǎn)染的方法，而不是直接轉(zhuǎn)染成熟的 miRNAs。同年，Miyoshi 等[64]直接轉(zhuǎn)染 3 個(gè)成熟 miRNAs（miR-200c、-302c 和 -369c）到小鼠和人的脂肪干細(xì)胞中成功生成 iPSCs。利用此方法獲得 iPSCs 效率相對(duì)較低，但因不涉及病毒載體的使用，安全性大大提高。另外，2012 年，F(xiàn)oja 等[65]發(fā)現(xiàn)結(jié)合成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 2（FGF2）和缺氧培養(yǎng)，能夠有效地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）的重編程，其原因可能與誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性 MSC 特異的 miR-302 簇并激活 Oct4 和 Nanog 有關(guān)。

4 結(jié)論和展望

從已報(bào)道的文獻(xiàn)來(lái)看，目前用于制備 iPSCs 的分子系統(tǒng)優(yōu)化改造思路主要有以下三方面：

⑴盡可能地棄用或替換 c-Myc[4,23]和 Klf4[24]轉(zhuǎn)錄因子，因?yàn)閮烧呔哂袑?dǎo)致細(xì)胞異常增生的作用，將誘導(dǎo)成功的 iPSCs 用于患者體內(nèi)進(jìn)行臨床治療時(shí)有引發(fā)癌癥的潛在 風(fēng)險(xiǎn)。

⑵尋找更安全的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。由于多數(shù)病毒載體可整合到靶細(xì)胞基因組中，存在發(fā)生插入突變或激活癌基因等導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定的風(fēng)險(xiǎn)，近年來(lái)不少實(shí)驗(yàn)室嘗試使用不同類(lèi)型的載體系統(tǒng)，如傳統(tǒng)質(zhì)粒載體[35]、oriP/EBNA1 系統(tǒng)[40]、PB 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[41-42]、ΦC31 整合酶系統(tǒng)[43]等，來(lái)替代病毒載體，尋求更安全高效生產(chǎn) iPSCs 的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。這些非病毒載體都可成功地將體細(xì)胞誘導(dǎo)為 iPSCs，但重編程效率非常低。另外，多種基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)相結(jié)合，如 Cre/loxP 重組系統(tǒng)分別與病毒載體系統(tǒng)[27]、ΦC31 整合酶系統(tǒng)[49]、PB 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[44]等聯(lián)合使用，在 iPSCs 成功誘導(dǎo)后刪除外源轉(zhuǎn)錄因子，可提高 iPSCs 的安全性。

⑶非 DNA 轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的使用。雖然上述非整合型載體在一定程度上避免了插入突變等風(fēng)險(xiǎn)，但其畢竟為 DNA 載體系統(tǒng)，不能完全排除沒(méi)有任何基因組修飾現(xiàn)象的發(fā)生，仍有染色體插入突變而引起腫瘤發(fā)生的可能，具有實(shí)際應(yīng)用的局限性。通過(guò)重編程蛋白、mRNA 或 miRNAs 來(lái)誘導(dǎo)獲得 iPSCs 克服了潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，因此，這些方法擁有更好的應(yīng)用前景。

另外，體細(xì)胞在重編程的過(guò)程中引入一些小分子化合物如 5-氮（雜）胞苷、丙戊酸、維生素 C 等可提高重編程效率[66-68]，但這些小分子化合物系統(tǒng)僅能替代某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，并不能起到關(guān)鍵性誘導(dǎo)重編程的作用。因此，上述 DNA、RNA、蛋白質(zhì)誘導(dǎo)系統(tǒng)依然是 iPSCs 研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，尤其是 RNA、蛋白質(zhì)誘導(dǎo)系統(tǒng)，為制備 iPSCs 的研究提供了新思路。隨著 iPS 誘導(dǎo)機(jī)制、安全性及誘導(dǎo)效率的深入研究，相信 iPSCs 從實(shí)驗(yàn)室走向臨床并不遙遠(yuǎn)。

[1] Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126(4):663-676.

[2] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell, 2007, 131(5):861-872.

[3] Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007, 318(5858):1917-1920.

[4] Yoshida Y, Yamanaka S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation, 2010, 122(1):80-87.

[5] Zhao XY, Li W, Lv Z, et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation. Nature, 2009, 461(7260):86-90.

[6] Boland MJ, Hazen JL, Nazor KL, et al. Adult mice generated from induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, 461(7260):91-94.

[7] Lee G, Studer L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods, 2010(7):25-27.

[8] Fujimoto Y, Abematsu M, Falk A, et al. Treatment of a mouse modle of spinal cord injury by transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived long-term self-renewing neuroepithelial-like stem cells. Stem Cells, 2012, 30(6):1163-1173.

[9] Jung YW, Hysolli E, Kim KY, et al. Human induced pluripotent stem cells and neurodegenerative disease: prospects for novel therapies. Curr Opin Neurol, 2012, 25(2):125-130.

[10] Ooi L, Sidhu K, Poljak A, et al. Induced pluripotent stem cells as tools for disease modelling and drug discovery in Alzheimer's disease. J Neural Transm, 2013, 120(1):103-111.

[11] Brambrink T, Foreman R, Welstead GG, et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell, 2008, 2(2):151-159.

[12] Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol, 2008, 26(1):101-106.

[13] Huangfu D, Maehr R, Guo W, et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol, 2008, 26(7):795-797.

[14] Huangfu D, Osafune K, Maehr R, et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol, 2008, 26(11):1269-1275.

[15] Kim JB, Zaehres H, Wu G, et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature, 2008, 454(7204):645-650.

[16] Kim JB, Sebastiano V, Wu G, et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell, 2009, 136(3):411-419.

[17] Durand S, Cimarelli A. The inside out of lentiviral vectors. Viruses, 2011, 3(2):132-159.

[18] Cattoglio C, Facchini G, Sartori D, et al. Hot spots of retroviral integration in human CD34+ hematopoietic cells. Blood, 2007, 110(6):1770-1778.

[19] Shao L, Feng W, Sun Y, et al. Generation of iPS cells using defined factors linked via the self-cleaving 2A sequences in a single open reading frame. Cell Res, 2009, 19(3):296-306.

[20] Sommer CA, Stadtfeld M, Murphy GJ, et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells, 2009, 27(3):543-549.

[21] Chang CW, Lai YS, Pawlik KM, et al. Polycistronic lentiviral vector for "Hit and run" reprogramming of adult skin fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells, 2009, 27(5):1042-1049.

[22] Carey BW, Markoulaki S, Hanna J, et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vectors. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(1):157-162.

[23] Yamanaka S. A fresh look at iPS cells. Cell, 2009, 137(1):13-17.

[24] Yamanaka S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2008, 363(1500):2079-2087.

[25] Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 2007, 448(7151):313-317.

[26] Hochedlinger K, Yamada Y, Beard C, et al. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissuses. Cell, 2005, 121(3):465-477.

[27] Soldner F, Hockemeyer D, Beard C, et al. Parkinson's disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell, 2009, 136(5):964-977.

[28] Sakahara M, Ohkawara H, Nakao K, et al. The simultaneous induction of tumorigenesis and Cre-loxP recombination in mice. Kobe J Med Sci, 2009, 54(6):E279-E289.

[29] Kim K, Kim H, Lee D. Site-specific modification of genome with cell-permeable Cre fusion protein in preimplantation mouse embryo. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 388(1):122-126.

[30] Van Duyne GD. A structural view of cre-loxp site-specific recombination. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2001, 30:87-104.

[31] Kozarsky KF, Wilson JM. Gene therapy: adenovirus vectors. Curr Opin Genet Dev, 1993, 3(3):499-503.

[32] Thomas CE, Ehrhardt A, Kay MA. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet, 2003, 4(5): 346-358.

[33] Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, et al. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science, 2008, 322(5903):945- 949.

[34] Shao L, Wu WS. Gene-delivery systems for iPS cell generation. Expert Opin Biol Ther, 2010, 10(2):231-242.

[35] Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science, 2008, 322(5903):949-953.

[36] Jia F, Wilson KD, Sun N, et al. A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells. Nat Methods, 2010, 7(3):197-199.

[37] Chen ZY, He CY, Meuse L, et al. Silencing of episomal transgene expression by plasmid bacterial DNA elements in vivo. Gene Ther, 2004, 11(10):856-864.

[38] Chen ZY, He CY, Ehrhardt A, et al. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Mol Ther, 2003, 8(3):495-500.

[39] Chen ZY, He CY, Kay MA. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Hum Gene Ther, 2005, 16(1):126-131.

[40] Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science, 2009, 324(5928):797-801.

[41] Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature, 2009, 458(7239):766-770.

[42] Kaji K, Norrby K, Paca A, et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature, 2009, 458(7239):771-775.

[43] Wang W, Lin C, Lu D, et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(27):9290-9295.

[44] Guo G, Yang J, Nichols J, et al. Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency. Development, 2009, 136(7):1063-1069.

[45] Ye L, Chang JC, Lin C, et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(45):19467-19472.

[46] Thyagarajan B, Olivares EC, Hollis RP, et al. Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phage phiC31 integrase. Mol Cell Biol, 2001, 21(12):3926-3934.

[47] Chalberg TW, Portlock JL, Olivares EC, et al. Integration specificity of phage phiC31 integrase in the human genome. J Mol Biol, 2006, 357(1):28-48.

[48] Tenzen T, Zembowicz F, Cowan CA. Genome modification in human embryonic stem cells. J Cell Physiol, 2010, 222(2):278-281.

[49] Karow M, Chavez CL, Farruggio AP, et al. Site-specific recombinase strategy to create induced pluripotent stem cells efficiently with plasmid DNA. Stem Cells, 2011, 29(11):1696-1704.

[50] Schwarze SR, Hruska KA, Dowdy SF. Protein transduction: unrestricted delivery into all cells? Trends Cell Biol, 2000, 10(7):290- 295.

[51] Matsui H, Tomizawa K, Lu YF, et al. Protein Therapy: in vivo protein transduction by polyarginine (11R) PTD and subcellular targeting delivery. Curr Protein Pept Sci, 2003, 4(2):151-157.

[52] Zhou H, Wu S, Joo JY, et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell, 2009, 4(5):381-384. [53] Kim D, Kim CH, Moon JL, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell, 2009, 4(6):472-476.

[54] Vivès E, Brodin P, Lebleu B. A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem, 1997, 272(25):16010- 16017.

[55] Zhang H, Ma Y, Gu J, et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials, 2012, 33(20):5047-5055.

[56] Oh SI, Lee CK, Cho KJ, et al. Technological progress in generation of induced pluripotent stem cells for clinical applications. ScientificWorldJournal, 2012, 2012:417809.

[57] Li GH, Li W, Mumper RJ, et al. Molecular mechanisms in the dramatic enhancement of HIV-1 Tat transduction by cationic liposomes. FASEB J, 2012, 26(7):2824-2834.

[58] Hitsuda T, Michiue H, Kitamatsu M, et al. A protein transduction method using oligo-arginine (3R) for the delivery of transcription factors into cell nuclei. Biomaterials, 2012, 33(18):4665-4672.

[59] Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 2009, 85(8):348-362.

[60] Ban H, Nishishita N, Fusaki N, et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(34):14234-14239.

[61] Macarthur CC, Fontes A, Ravinder N, et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem Cells Int, 2012, 2012:564612.

[62] Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell, 2010, 7(5):618-630.

[63] Anokye-Danso F, Trivedi CM, Juhr D, et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell, 2011, 8(4):376-388.

[64] Miyoshi N, Ishii H, Nagano H, et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell Stem Cell, 2011, 8(6):633-638.

[65] Foja S, Jung M, Harwardt B, et al. Hypoxia supports reprogramming of mesenchymal stromal cells via induction of embryonic stem cell-specific microRNA-302 cluster and pluripotency-associated genes. Cell Reprogram, 2012.

[66] Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang X, et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature, 2008, 454(7200):49-55.

[67] Huangfu D, Maehr R, Guo W, et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol, 2008, 26(7):795-797.

[68] Esteban MA, Wang T, Qin B, et al. Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2010, 6(1):71-79.