生物樣本質(zhì)量的影響因素與評(píng)估

胡穎，張連海，宋麗潔，王易雪，季加孚

樣本質(zhì)量是整個(gè)樣本庫(kù)的核心，樣本應(yīng)該在盡可能嚴(yán)格的條件下進(jìn)行采集、處理、保存、運(yùn)輸以及后期加工。樣本庫(kù)的工作就是盡可能地將對(duì)樣本質(zhì)量的影響降低到最小，除了嚴(yán)格質(zhì)量管理的制度外，新技術(shù)的不斷研發(fā)、理論研究的不斷豐富將有助于評(píng)估影響樣本質(zhì)量的因素，從而制定或改進(jìn)有關(guān)樣本的標(biāo)準(zhǔn)流程以盡量減少樣本質(zhì)量的變化，保持樣本的原有性質(zhì)。

目前將影響樣本質(zhì)量以及最終影響樣本相關(guān)檢測(cè)結(jié)果的因素籠統(tǒng)地分為兩類：分析前因素或變量（pre-analytical factors or variables）與分析因素（analytical factors）。其中，分析前因素對(duì)樣本質(zhì)量的影響較大，而分析因素主要是在分析過(guò)程中采用對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)化等措施盡可能減少分析前因素造成的影響，盡量反映樣本的真實(shí)情況，它也決定了最終的分析結(jié)果。

因此，在進(jìn)行樣本分析之前，首先要了解有多種因素決定樣本的質(zhì)量——分析前因素或變量。這些分析前因素，包括生物變異、樣本收集、處理和貯存等的技術(shù)差異，將導(dǎo)致分析前樣本的狀態(tài)與樣本在患者體內(nèi)的狀態(tài)存在差異。

1 生物樣本質(zhì)量的影響因素

1.1 分析前因素

分析前因素按照時(shí)間先后可劃分為三類：樣本采集前患者狀態(tài)；樣本的采集以及樣本采集后到分析前所經(jīng)歷的處理過(guò)程[1]。表 1 列舉了常見(jiàn)的影響樣本質(zhì)量的分析前因素。

表1 常見(jiàn)的影響樣本質(zhì)量的分析前因素

1.1.1 樣本采集前患者的狀態(tài) 研究表明分析物的水平可能會(huì)受各種因素影響，如患者的整體健康狀態(tài)、采樣前攝入的食品和飲料、用藥情況、甚至采集所處一天內(nèi)的時(shí)間。額外的因素，如女性月經(jīng)周期的不同階段也可能會(huì)影響一些下游的分析，應(yīng)努力收集和記錄有關(guān)這些變量的信息。

1.1.2 樣本的采集過(guò)程 從患者處收集生物樣本可能會(huì)影響生物樣本的質(zhì)量。相關(guān)研究已經(jīng)明確表明，在生物樣本離體后熱缺血的時(shí)間會(huì)影響分析結(jié)果的總體特征和水平[2]。因此，生物樣本從患者體內(nèi)取出后應(yīng)該盡快保存，比如分割成適當(dāng)?shù)拇笮?，快速冷凍或者放入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)液中保存。當(dāng)生物樣本從患者處采集時(shí)，生物樣本被移除的位置（如腫瘤或非腫瘤，以及在腫瘤內(nèi)部的位置），任何被使用的麻醉劑，組織器官血液斷流的時(shí)間，任何在切除后用于穩(wěn)定保存生物樣本的試劑，各種類型的固定方式和暴露在各種固定試劑中的時(shí)間，以及生物樣本在采集后所處的溫度都可能會(huì)影響分子的穩(wěn)定性和降解的速度。

因此，在收集離體后的生物樣本時(shí)，應(yīng)該有計(jì)劃地對(duì)生物樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖⑨?。這些注釋?xiě)?yīng)該包括患者的信息和采集、處理的時(shí)間，例如清潔劑的類型、樣本處理過(guò)程中石蠟的類型和溫度等。這些數(shù)據(jù)應(yīng)該保存在一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)里以便隨時(shí)查閱。

1.1.3 分析前的樣本處理 盡所有可能嘗試并優(yōu)化處理，從而將生物樣本處置過(guò)程中的分子變化降低到最小。這不僅包括生物樣本處理的溫度和時(shí)間，還應(yīng)考慮諸如以何種大小和容量的容器進(jìn)行存儲(chǔ)，以備將來(lái)使用。較小的樣本僅允許盡可能少的凍融。當(dāng)樣品存儲(chǔ)在冰凍狀態(tài)下時(shí)，它們被冷卻到儲(chǔ)存溫度的速率也會(huì)影響分子降解的速度。儲(chǔ)存到樣本應(yīng)用前的其他因素，諸如運(yùn)輸條件、溫度變化等也會(huì)影響到樣本的質(zhì)量，從而影響到樣本最終的檢測(cè)結(jié)果。

針對(duì)以上這些分析前因素，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所生物樣本庫(kù)和生物樣本研究辦公室推薦使用代碼形式進(jìn)行標(biāo)識(shí)[3]。該標(biāo)識(shí)將組織和血液樣本進(jìn)行了區(qū)分。雖然增加了工作量，但是的確為今后樣本流程持續(xù)改進(jìn)提供了重要證據(jù)。該編碼系統(tǒng)針對(duì)液體和固體采用不同的代碼，代碼為 7 位，分別代表樣本的多項(xiàng)分析前參數(shù)，下面是采用該代碼的實(shí)例：

液體 PL2-SED-B-B-E-A-G

（PL2）樣本類型：血漿 2 次離心；（SED）儲(chǔ)存容器：EDTA 抗凝；（B）離心前時(shí)間：3 ～ 7 ℃，< 2 h；（B）離心：< 3000 × g，室溫 10 min；（E）二次離心：室溫 10 min （3000 ～ 6000）× g；（A）離心后時(shí)間：< 1 h，3 ～ 7 ℃；（G）儲(chǔ)存條件：–85 ～ –60 ℃ 細(xì)管儲(chǔ)存。

固體 TIS-BPS-N-B-RNL-A-A

（TIS）樣本類型：固體組織；（BPS）采集類型：活檢；（N）熱缺血時(shí)間：不適用（例如活檢）；（B）冷缺血時(shí)間：2 ～ 10 min；（RNL）固定類型：RNA later；（A）固定時(shí)間：< 15 min；（A）儲(chǔ)存條件：PP 管 0.5 ～ 2 ml，–85 ～ –60 ℃。

這種使用代碼標(biāo)識(shí)的方法，較為規(guī)范地給每份樣本附上分析前因素的情況，雖然繁瑣，但方便了今后對(duì)樣本的質(zhì)量進(jìn)行追溯。

1.2 分析因素

當(dāng)樣本進(jìn)入特定的分析階段時(shí)，分析前因素帶入特定分析中，將給分析結(jié)果帶來(lái)不同程度的影響。而分析因素主要是在分析過(guò)程中采用對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)化等措施盡可能減少分析前因素造成的影響，盡量反映樣本的真實(shí)情況。同時(shí)，分析因素也可以增加檢測(cè)的可重復(fù)性，確保試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠。實(shí)際操作中，應(yīng)考慮以下的分析相關(guān)因素：①為確保研究的準(zhǔn)確性，有可能的話，盡量進(jìn)行驗(yàn)證研究；②對(duì)技術(shù)人員進(jìn)行檢測(cè)流程的標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)；③試劑種類、批號(hào)盡量保持一致；④包含適當(dāng)類型和數(shù)量的質(zhì)量控制（參考）樣品；⑤研究過(guò)程中樣本的取舍應(yīng)該盡量做到隨機(jī)；⑥采用標(biāo)準(zhǔn)化的方法來(lái)記錄和解釋測(cè)試結(jié)果。

將影響樣本質(zhì)量的分析前因素與分析因素進(jìn)行細(xì)化，可以提高樣本的質(zhì)量，但更為重要的是通過(guò)這樣接近量化的標(biāo)識(shí)與管理，為樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序（standard operation procedure，SOP）[4-5]的建立提供可以量化的依據(jù)。為了獲得高質(zhì)量的樣本，減少不規(guī)范操作流程對(duì)樣本質(zhì)量造成的影響，增加后續(xù)分析結(jié)果的可靠性，需要建立標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并通過(guò)測(cè)量因素對(duì)結(jié)果的影響不斷地改進(jìn)現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序。也就是：樣本的日常工作所參照的作業(yè)指導(dǎo)書(shū)所基于的證據(jù)的主要來(lái)源是分析前后樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)，通過(guò)詳細(xì)記錄分析前變量，結(jié)合之后的分析結(jié)果，測(cè)算變量對(duì)結(jié)果的影響，從而得出評(píng)估現(xiàn)行的 SOP 流程規(guī)劃，提出改進(jìn)的意見(jiàn)與建議。

2 樣本質(zhì)量的評(píng)估

由于分析前因素的存在，因此需要對(duì)樣本質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，從而了解在生物樣本的采集、處理、儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)中的處理方式對(duì)樣本分子水平的變化，乃至測(cè)試結(jié)果的影 響[6]。對(duì)樣本質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估應(yīng)該是較為全面的，或有針對(duì)性的，樣本質(zhì)量評(píng)估通常是指從病理形態(tài)、分子水平和特定指標(biāo)等方面對(duì)樣本進(jìn)行評(píng)價(jià)并判斷其是否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)分析庫(kù)存標(biāo)本的 DNA、RNA、蛋白質(zhì)或者特定的分子成分，定期對(duì)保存的樣本質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，了解樣本質(zhì)量，同時(shí)探索影響樣本質(zhì)量的因素，從而有效地對(duì)樣本庫(kù)流程進(jìn)行持續(xù) 改進(jìn)。

對(duì)于樣本質(zhì)量評(píng)估，首先要明確的一個(gè)概念就是評(píng)價(jià)樣本好壞的標(biāo)準(zhǔn)并不是一成不變的“死標(biāo)準(zhǔn)”。不同樣本和對(duì)樣本的不同使用要求決定了樣本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法不盡相同。針對(duì)進(jìn)行某一特定研究?jī)?nèi)容的特定類型的樣本，質(zhì) 量檢測(cè)過(guò)程應(yīng)該建立標(biāo)準(zhǔn)的流程，使用標(biāo)準(zhǔn)參考方案、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)參考試劑，以及盡可能使用質(zhì)量穩(wěn)定的可參考標(biāo)準(zhǔn)生物樣本（例如質(zhì)量確認(rèn)的體外培養(yǎng)細(xì)胞）等，并保證標(biāo)準(zhǔn)品的研究結(jié)果可重復(fù)。

另外，由于現(xiàn)有技術(shù)水平的限制，檢測(cè)生物樣本中每一個(gè)部分的質(zhì)量情況是不可能實(shí)現(xiàn)的，因此，目前檢測(cè)通常只評(píng)價(jià)某一特定環(huán)境條件下生物樣本分子成分的總體穩(wěn)定程度。如果后期研究中將主要涉及某一個(gè)或多個(gè)特定的分子，就必須就這些特定的分子針對(duì)性地進(jìn)行檢測(cè)。

檢測(cè)的方案盡量采用經(jīng)典的、廣泛認(rèn)可的試驗(yàn)技術(shù)。但即便是那些經(jīng)典的技術(shù)，也應(yīng)該反復(fù)測(cè)定以保證技術(shù)本身隨時(shí)間的變化仍能保持穩(wěn)定。國(guó)際生物和環(huán)境資源協(xié)會(huì)推薦“能力證據(jù)”測(cè)試（“proof of performance” test），即在一定時(shí)間范圍內(nèi)測(cè)試復(fù)制的同一樣本，以測(cè)算檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)確立類似這樣的檢測(cè)，以確保存儲(chǔ)和處理過(guò)程有利于保證生物樣本中分子成分與質(zhì)量。其中內(nèi)容有：

2.1 質(zhì)量評(píng)估需制定標(biāo)準(zhǔn)和建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序

每個(gè)生物資源庫(kù)都應(yīng)有一套完整的樣本質(zhì)量評(píng)估體系。樣本庫(kù)應(yīng)根據(jù)質(zhì)量管理的要求，樣本質(zhì)量保證的標(biāo)準(zhǔn)以及樣本庫(kù)的實(shí)際情況，建立適合本樣本庫(kù)的質(zhì)量管理體系并形成書(shū)面文件，然后實(shí)施和保持并持續(xù)改進(jìn)以保證體系的有效性。評(píng)估的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性受操作水平的影響，因此，應(yīng)保證評(píng)估人員必須是獨(dú)立的，有經(jīng)驗(yàn)或者經(jīng)過(guò)相關(guān)培訓(xùn)。

2.2 建立定期隨機(jī)抽檢機(jī)制

質(zhì)量評(píng)價(jià)是一個(gè)系統(tǒng)性的工作，需要建立完善的制度保證其規(guī)律實(shí)施，這個(gè)制度就是定期隨機(jī)抽檢機(jī)制。定期隨機(jī)抽檢就是周期性地從樣本庫(kù)保存的所有樣本中按照隨機(jī)抽樣的原則，抽取一定比例的樣本進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。根據(jù)樣本評(píng)價(jià)結(jié)果判斷樣本儲(chǔ)存是否存在問(wèn)題，進(jìn)而及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題并改正。

2.3 重視質(zhì)量反饋

生物樣本庫(kù)的一個(gè)重要作用是為研究人員提供實(shí)驗(yàn)樣品。樣本庫(kù)在向使用者提供樣本的同時(shí)應(yīng)該將該樣本相關(guān)的質(zhì)量評(píng)估信息同時(shí)提供給使用者，以便使用者判斷該樣本是否能用于特定的研究。同時(shí)，樣本的使用過(guò)程本身就是對(duì)樣本質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程，因此使用者對(duì)樣本質(zhì)量的反饋信 息對(duì)于樣本質(zhì)量控制有著重要意義，應(yīng)該予以重視。根據(jù)反 饋意見(jiàn)評(píng)估樣本的質(zhì)量，并改進(jìn)采集、儲(chǔ)存以及處理樣本的方法。

2.4 確認(rèn)過(guò)程中人員的職責(zé)

確認(rèn)程序應(yīng)對(duì)確認(rèn)過(guò)程中樣本庫(kù)相關(guān)人員的具體責(zé)任做出明確的規(guī)定，一般而言，安排如下：①樣本庫(kù)負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)選用的檢驗(yàn)方法；②技術(shù)負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行確認(rèn)和評(píng)審，以及對(duì)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行審核；③實(shí)際檢測(cè)人員負(fù)責(zé)編制檢測(cè)方法作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，并驗(yàn)證檢測(cè)方法。

2.5 質(zhì)量檢測(cè)的內(nèi)容

樣本庫(kù)儲(chǔ)存的樣本一般為組織樣本、血液樣本以及提取的衍生分子樣本等。針對(duì)不同樣本可選用不同方法從病理形 態(tài)、分子水平上對(duì)樣本進(jìn)行評(píng)估。目前沒(méi)有特別理想的針對(duì)血液（比如血清、血漿等）的通用質(zhì)量檢測(cè)手段，嚴(yán)格的流程質(zhì)量控制是目前血液類樣本主要的質(zhì)量保證手段。目前較多質(zhì)量評(píng)估的方法主要是針對(duì)冰凍組織樣本。

2.5.1 組織樣本病理評(píng)價(jià) 通常的組織樣本在進(jìn)入樣本庫(kù)前或者進(jìn)入后的短時(shí)間內(nèi)，需要對(duì)樣本的病理狀況進(jìn)行評(píng) 價(jià)。有時(shí)也將評(píng)價(jià)放在后續(xù)項(xiàng)目研究前進(jìn)行。但是無(wú)論如何，組織樣本的病理評(píng)價(jià)都應(yīng)該是必須的（圖 1）。

圖1 冰凍組織的病理檢測(cè)報(bào)告

圖2 常見(jiàn)的組織樣本 RNA 質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

樣本庫(kù)儲(chǔ)存的樣本會(huì)與實(shí)際整體樣本存在差異。盡管樣本通常都會(huì)附有相關(guān)采集單位的病理報(bào)告，但是由于采集部位與實(shí)際病理取材部位在組織器官內(nèi)部的差異，樣本庫(kù)實(shí)際保存的樣本與病理報(bào)告中的組織仍存在一定差異，有時(shí)這種 差異會(huì)大到足以影響研究的結(jié)果。以惡性腫瘤為例，常見(jiàn)的不一致包括：腫瘤含量與分布、分化程度、腫瘤亞類的區(qū)別等。舉個(gè)實(shí)際遇到的例子：病理由于多點(diǎn)取材而且切片面積較大，報(bào)告腫瘤組織中同時(shí)含有腺癌成分與內(nèi)分泌癌成分，而樣本研究前冰凍組織切片病理顯示細(xì)胞形態(tài)與腺癌不同，后免疫組化考慮取材樣本為神經(jīng)內(nèi)分泌癌來(lái)源。

此外，筆者對(duì)同一樣本、同一次取材的不同分裝進(jìn)行病理分析發(fā)現(xiàn)，雖然是同一樣本的同一次取材，但是分裝不同，組織內(nèi)的分化程度和腫瘤含量比例也不同。另外，還有一點(diǎn)容易忽略的是當(dāng)病理診斷醫(yī)師采用的標(biāo)準(zhǔn)不同時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)差異較大，因此，盡量采用相同的標(biāo)準(zhǔn)，必要時(shí)需要與病理醫(yī)師進(jìn)行溝通。

在完成病理評(píng)估之后，往往要根據(jù)研究?jī)?nèi)容的需要對(duì)組織進(jìn)行修剪，諸如去掉多余的間質(zhì)成分，比如 RNA 表達(dá)的研究往往要求腫瘤組織成分在 70% 以上，而 DNA 水平的研究對(duì)組織成分的要求會(huì)更高。

對(duì)于活檢組織樣本的病理評(píng)估一般較難，冰凍切片后往往組織損失較大，活檢當(dāng)時(shí)的組織印片是一個(gè)比較可行的病理評(píng)估手段。

總之，忽略研究前對(duì)生物組織樣本的病理評(píng)價(jià)將對(duì)結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。

2.5.2 常見(jiàn)生物樣本的總體分子水平評(píng)價(jià) 一般來(lái)說(shuō)，樣本庫(kù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)很少針對(duì)特定的分子指標(biāo)，往往是總體分子水平的評(píng)價(jià)。一般來(lái)說(shuō)，RNA 相對(duì)于 DNA 更容易發(fā)生破壞和降解，通常多數(shù)研究者將 RNA 的完整性作為評(píng)價(jià)樣本質(zhì)量的重要指標(biāo)。而特定的分子水平或者特定分子的評(píng)價(jià)需要有針對(duì)性地完成。

由于 DNA、RNA、蛋白的提取方法在一般的分子生物學(xué)指南中都有詳細(xì)描述，這里就不再敘述。常見(jiàn)的質(zhì)控報(bào)告見(jiàn)圖 2。

總之，通過(guò)對(duì)生物樣本質(zhì)量影響因素的細(xì)化分析，對(duì)影響因素進(jìn)行詳細(xì)記錄，歸納總結(jié)，并通過(guò)技術(shù)手段對(duì)這種影響因素進(jìn)行量化，將有助于樣本庫(kù)正確流程的不斷改進(jìn)。

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