Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中鉀通道和JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用

田嘉瑩 田國忠 熊慶華 李梅秀 盛寶英△

1）佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)三科 佳木斯 154000 2）佳木斯大學(xué) 佳木斯 154000 3）佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院佳木斯 154000

阿爾茨海默?。ˋ1zheimer’s disease，AD）為老年人群中最常見的中樞退行性腦病。AD的特點為β－淀粉樣多肽（Aβ）聚集形成的老年斑及神經(jīng)元減少［1］。那么如何避免腦內(nèi)Aβ致使神經(jīng)元減少或者誘發(fā)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元并遷移受損部位進(jìn)行修復(fù)就成為現(xiàn)在最為關(guān)注的研究方向之一?，F(xiàn)研究證實Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，主要為細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡過程中除基因調(diào)控外，可由細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)尤其是鉀離子的穩(wěn)態(tài)調(diào)控。本實驗將探討鉀通道阻滯劑（tetraethy－1ammonium，TEA）作用于 Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中鉀通道的作用；c－Jun 氨基端激酶（c－Jun N－termina1kinases，JNK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在神經(jīng)干細(xì)胞死亡過程中磷酸化的改變及鉀通道與JNK的關(guān)系，從而進(jìn)一步了解AD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物、主要試劑及主要儀器 雄性 Wistar大鼠＜24h，由佳木斯大學(xué)動物中心提供；四乙胺、MTT、SP600125、Hoechst33342（Sigma公司）；Aβ1－40（Biosouxee公司）；Caspase分析試劑盒（美國Promega公司）；二抗（進(jìn)口分裝）；Nestin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；DAB試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司）；Actin多克隆抗體（Santa cruz公司）；10－200 kDa蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（Fermentas）。酶標(biāo)計數(shù)儀E1X800（Bio－TEK公司）；IBE2003倒置熒光顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）。

1．2 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的分離與傳代培養(yǎng)及鑒定 新生的 Wistar大鼠（＜24h），取海馬組織，用 Hank’s液進(jìn)行漂洗，將組織剪成1mm3左右的小塊加入培養(yǎng)液（DMEM／F12 1：1，2%B27，bFGF 20μg／L，表皮生長因子20μg／L）5 mL，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整一定濃度后接種于培養(yǎng)瓶中，將其放入5%CO2培養(yǎng)箱中，每3d換半量培養(yǎng)液一次，每7d傳代一次。取傳代穩(wěn)定的神經(jīng)干細(xì)胞行Nestin細(xì)胞免疫化學(xué)檢測。

1．3 實驗分組 實驗一共分4組：Aβ1－40組：將傳三代后的神經(jīng)干細(xì)胞加入 Aβ1－405μm；Aβ1－40＋TEA組：在 Aβ1－405μm孵育前30min加入TEA 5mm；TEA對照組：神經(jīng)干細(xì)胞加入TEA 5mm；空白對照組：加入等量的培養(yǎng)液的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)組。上述各組分別在0h、12h、24h和48h各時間點行細(xì)胞活性及凋亡檢測。

實驗二共分4組：Aβ1－40組：在傳三代后的神經(jīng)干細(xì)胞加入 Aβ1－405μm；Aβ1－40＋SP600125組：在 Aβ1－405μm 孵育前30 min加入SP 600125 10μm；SP對照組：神經(jīng)干細(xì)胞加入SP600125 10μm；空白對照組：加入等量的培養(yǎng)液的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)組。上述各組分別在0h、12h、24h和48h各時間點行細(xì)胞活性及凋亡檢測。

1．4 MTT法 將 MTT溶液（5mg／mL）20μL加入細(xì)胞中，放置37℃培養(yǎng)箱，將96孔板內(nèi)的培養(yǎng)基棄去，加入溶解液DMSO 150μL，振蕩10min使其充分溶解結(jié)晶產(chǎn)物。在酶標(biāo)儀上以波長490nm檢測每孔的OD值。每組設(shè)3個孔，實驗重復(fù)3次，細(xì)胞存活率的計算：細(xì)胞存活率＝試驗組光吸收值／對照組光吸收值×100%。

1．5 Hoechst33342法 將Hoechst33342加入各組細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)箱30min。加入4%多聚甲醛與培養(yǎng)液以1：3混合，固定細(xì)胞10min。固定好后，將細(xì)胞懸液涂在載玻片上加蓋玻片。熒光顯微鏡下在紫外（UV濾光片）激發(fā)下觀察結(jié)果。隨機(jī)選取10個視野統(tǒng)計每個視野中的陽性細(xì)胞數(shù)，至少重復(fù)3次，計算細(xì)胞凋亡發(fā)生率。

1．6 比色法 用PBS在細(xì)胞表面漂洗2次，收集到EPPendoff管內(nèi)，450×g 4℃離心10min收集細(xì)胞。放于冰上，用冰冷的PBS漂洗一次，然后懸浮在100μL細(xì)胞裂解緩沖液中。以液氮－常溫的方式裂解細(xì)胞，然后在冰上孵育15 min。15000×g 4℃離心20min后收集上清液。用Bradford方法測蛋白的濃度。按試劑盒依次在96孔板內(nèi)依次加樣。加2μL DEVD－pNA 底 物 （10mm）到 96 孔 板 內(nèi)。用parafi1m封口膜將板子封嚴(yán)，37℃孵育4h。在405nm測量吸光度，計算Caspase－3特異性活性。

1．7 Western b1ot方法 將細(xì)胞在冰上去除培養(yǎng)液，PBS洗一次，每孔加入含PMSF的細(xì)胞裂解液50μL，冰上孵育30min，刮取細(xì)胞移入EP管中，4℃12 000rpm離心5min，吸取上清液轉(zhuǎn)移入EP管－70℃保存。用細(xì)胞蛋白總濃度測定試劑盒測出每個蛋白標(biāo)本的蛋白質(zhì)濃度，加入1oading buffer。配膠，上樣，電泳，半干轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過夜，PBST洗膜，加二抗，搖床搖1h，PBST洗膜，加發(fā)光液發(fā)光，image J軟件分析。

2 結(jié)果

2．1 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及Nestin抗原表達(dá) 新生大鼠分離海馬區(qū)的單個神經(jīng)干細(xì)胞3d后呈透亮的圓形，傳代培養(yǎng)至第三代可見培養(yǎng)液中形成較大的神經(jīng)球，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記性蛋白Nestin的表達(dá)呈陽性。

2．2 TEA對 Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞存活率、凋亡率及caspase－3活性的影響

2．2．1 TEA對 Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞的存活率的影響：Aβ1－40組神經(jīng)干細(xì)胞在不同的時間點，細(xì)胞存活明顯減少（P＜0．05），且隨時間延長細(xì)胞存活率下降（P＜0．05）。Aβ1－40＋TEA組較 Aβ1－40組細(xì)胞存活率明顯增加（P＜0．05），而空白對照組和TEA對照組神經(jīng)干細(xì)胞存活率無明顯改變（P＞0．05）。

2．2．2 TEA對 Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響：熒光鏡下與空白對組相比Aβ1－40組神經(jīng)干細(xì)胞48h后出現(xiàn)部分細(xì)胞核呈濃染的碎塊狀，典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，凋亡率（20．3±0．6）%，（P＜0．01）。Aβ1－40＋TEA 組較 Aβ1－40組細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化少，凋亡發(fā)生率明顯下降（11．6±0．4）%，差異具有顯著性（P＜0．01）。

2．2．3 TEA對 Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞 Caspase－3活性的影響：Aβ1－40＋TEA 組在各時間點均可降低 Caspase－3的表達(dá)（P＜0．05），特別在24h這種趨勢更為明顯（P＜0．01），而空白對照組和TEA對照組在各時間點Caspase－3特異性活性未發(fā)生明顯改變。

2．3 JNK及JNK的選擇性阻斷劑SP600125對 Aβ1－40誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞磷酸化的影響

2．3．1 β1－40誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的JNK磷酸化的表達(dá)：神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)Aβ1－405μm孵育48h，不同時間點JNK的磷酸化均有表達(dá)。JNK磷酸化水平隨著時間的延長也逐漸增加，在24h達(dá)到高峰（P＜0．01）。并且JNK的阻斷劑SP600125可顯著阻斷這種激活。

2．3．2 SP600125對 Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞的存活率影響：Aβ1－40＋ SP600125組與 A1－40組相比可明顯減輕神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，使神經(jīng)干細(xì)胞的存活率從（72．7±3．2）%、（50．35±2．7）%、（42．7±7．3）%分別增加到（92．6±0．70）%，（76．1±0．73）%、（67．0±0．64）%，P＜0．01。

2．3．3 SP600125對 Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的情況：Aβ1－40＋SP600125組可明顯降低5μm Aβ1－40孵育引起的神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡的發(fā)生，SP600125使凋亡發(fā)生率從（0．3±0．6）%降至（9．6±1．3）%（P＜0．01）。而SP600125組無明顯變化，說明SP600 125本身不影響細(xì)胞的凋亡。

2．3．4 SP600125對 Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞 Caspase－3活性的變化：在檢查JNK阻斷劑SP600125的作用時，Aβ1－40＋SP600125組可顯著減少 Caspase－3的激活，從 Aβ1－40組的（12．46±0．47）pmo1／（h·μg）下降到（5．09±0．40）pmo1／（h·μg）（n＝3，P＜0．01）。

2．4 TEA對Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞JNK磷酸化表達(dá)的影響 Aβ1－40＋TEA組較 Aβ1－40組JNK磷酸化表達(dá)顯著降低（P＜0．01）。而空白對照組和TEA組神經(jīng)干細(xì)胞JNK磷酸化表達(dá)無明顯改變（P＞0．05）。

3 討論

AD是與衰老相關(guān)，以嚴(yán)重的高級認(rèn)知功能障礙為特征的隱襲性退行性腦病，其發(fā)病機(jī)制至今未明［2－3］。病理學(xué)特點為Aβ聚集成老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成及神經(jīng)元減少［4－5］，其中Aβ聚集造成細(xì)胞凋亡是AD發(fā)病的關(guān)鍵因素之一。

在成年哺乳動物正常腦組織中海馬齒狀回的顆粒下層及側(cè)腦室壁的腦室下層存在神經(jīng)干細(xì)胞聚集，這些細(xì)胞增生活躍，特別在缺血缺氧情況下神經(jīng)元損傷及丟失可刺激這些區(qū)域神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化并對其進(jìn)行補(bǔ)充。研究表明，AD患者補(bǔ)充“救活”機(jī)制卻沒有發(fā)生，表現(xiàn)為神經(jīng)元持續(xù)性的缺失。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Aβ1－40孵育后神經(jīng)干細(xì)胞增殖減速，凋亡增多，且發(fā)育不良，這可能是神經(jīng)干細(xì)胞無法分化成相應(yīng)神經(jīng)元，而導(dǎo)致神經(jīng)元缺失增多的原因。

細(xì)胞凋亡不僅可由基因調(diào)控，也可由細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)尤其是K＋的穩(wěn)態(tài)調(diào)控。研究證實，心肌細(xì)胞凋亡中鉀通道被異常激活，K＋外向電流增加。同樣膽堿能干細(xì)胞株SN 56神經(jīng)元與Aβ共培養(yǎng)也得到相同的結(jié)果［6－7］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1－40與神經(jīng)干細(xì)胞共孵育時，細(xì)胞發(fā)生凋亡。鉀通道阻滯劑TEA可以明顯減輕Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞死亡，使神經(jīng)干細(xì)胞的存活率升高，凋亡的發(fā)生率明顯下降，從而推測在Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡時激活了鉀通道。本研究通過應(yīng)用TEA，在Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡模型中進(jìn)一步檢測了凋亡相關(guān)蛋白的改變與鉀通道之間的關(guān)系。

Caspases是哺乳動物細(xì)胞凋亡的主要相關(guān)蛋白酶家族。凋亡信號起動 Caspase－3的活化［8］，活化的 Caspase－3作用于底物蛋白，促進(jìn)底物分解，引起凋亡［9］。因此，通過檢測Caspase－3的活性大小即可了解細(xì)胞凋亡的變化。實驗中我們在 Aβ1－40孵育前加入 TEA 5mm 預(yù)處 理 30min，結(jié)果Caspase－3的活性被明顯抑制了，說明發(fā)生凋亡的過程中，鉀通道的激活上調(diào)，先于Caspase－3的激活。TEA有望成為治療AD的藥物作用靶點。但是鉀通道介導(dǎo)凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不明確。

絲裂原激活蛋白激酶 （MAPK）是細(xì)胞凋亡的一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中JNK和p38激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實驗利用Western b1ot方法檢測神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)Aβ1－40孵育后，JNK磷酸化水平，結(jié)果不同時間點JNK的磷酸化均有表達(dá)。JNK磷酸化水平隨著時間的延長也逐漸增加，并且JNK的阻斷劑SP600125可顯著阻斷這種激活。JNK特異性阻斷劑SP600125可抑制Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞相亡，對Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞毒性具有明顯的保護(hù)作用。研究證實，Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中，無論是體內(nèi)還是體外實驗，均有 Caspase－3的激活［10－11］。本研究進(jìn)一步證實Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡中Caspase－3的活性增加，且SP600125可以抑制Caspase－3的激活。說明JNK通路發(fā)生在Caspasc－3激活的上游。驗證JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞損傷中具有重要的作用。

鉀通道激活和JNK的磷酸化二者之間是否有聯(lián)系？本研究應(yīng)用TEA作用于Aβ1－40誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞檢測JNK磷酸化水平的變化，結(jié)果JNK磷酸化表達(dá)在各時間點均顯著降低。說明Aβ1－40引起的鉀通道激活和JNK磷酸化兩者之間有一定的相互聯(lián)系，進(jìn)而誘發(fā)了下游凋亡相關(guān)蛋白的改變。通過對AD發(fā)病機(jī)制的研究為神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的早期調(diào)控提供有益的補(bǔ)充，為進(jìn)一步開發(fā)治療AD藥物提供新的思路和方法。

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