針刺及川芎嗪對(duì)急性藥物性聾豚鼠耳蝸內(nèi)氧自由基生成影響實(shí)驗(yàn)研究

韓明訓(xùn) 趙烏蘭 王一鳴 王永華 沈曉麗 浙江中醫(yī)藥大學(xué)聽(tīng)力與言語(yǔ)科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

·論 著·

針刺及川芎嗪對(duì)急性藥物性聾豚鼠耳蝸內(nèi)氧自由基生成影響實(shí)驗(yàn)研究

韓明訓(xùn) 趙烏蘭 王一鳴 王永華 沈曉麗 浙江中醫(yī)藥大學(xué)聽(tīng)力與言語(yǔ)科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

目的：探討川芎嗪（TMP）、針刺單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)合使用對(duì)慶大霉素（GM）致聾豚鼠耳蝸內(nèi)氧自由基生成的影響。方法：50只健康豚鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、川芎嗪組、針刺組及TMP+針刺組，每組10只，正常組按2.5mL/（kg·d）劑量腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射慶大霉素100mg/（kg·d），連續(xù)14天，TMP組、針刺組、TMP+針刺組同時(shí)灌服TMP和（或）針刺相關(guān)穴位。造模結(jié)束后迅速斷頭處死，取耳蝸標(biāo)本。正常組與模型組動(dòng)物于用藥前及停藥后第1天分別測(cè)試聽(tīng)覺(jué)腦干誘發(fā)電位（ABR）以判斷造模是否成功；硫代巴比妥法檢測(cè)血清丙二醛（MDA），黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）。結(jié)果：各治療組與模型組比較MDA表達(dá)均明顯減少（P＜0.01），尤以TMP+針刺組改善明顯（P＜0.01）。各治療組SOD活力均有提高，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：針灸配合TMP明顯提高耳蝸組織內(nèi)SOD活力，防止脂質(zhì)過(guò)氧化，對(duì)急性耳毒性藥物早期損傷具有一定的防治作用。

豚鼠 藥物性聾 川芎嗪 針刺 氧自由基

自由基作為機(jī)體新陳代謝的正常副產(chǎn)物，體內(nèi)所有細(xì)胞均可產(chǎn)生，并且可被各種防御體系滅活，使之維持在正常水平。但是某些病理因素能導(dǎo)致自由基生成過(guò)多，從而對(duì)機(jī)體造成損傷[1]。川芎嗪（TMP）是中藥川芎的有效成分，能降低慶大霉素（GM）對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞的毒性損害[2]；而針刺臟腑組織器官所關(guān)聯(lián)的穴位可增強(qiáng)藥物在機(jī)體內(nèi)的靶向效應(yīng)[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察針刺和川芎嗪對(duì)GM致聾豚鼠耳蝸內(nèi)氧自由基的影響，探討川芎嗪（TMP）配合針刺對(duì)急性藥物性聾豚鼠的防治作用及機(jī)制。

1 材料與方法

用U/mL表示，MDA含量用μmol/L表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)比較用方差分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1 動(dòng)物選擇及實(shí)驗(yàn)分組 健康級(jí)白色紅目豚鼠50只，體質(zhì)量240～310g，雌雄各半，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（浙）2005-0021。所有動(dòng)物Preyer反射正常，無(wú)耳疾。隨機(jī)分為正常組、模型組、TMP組、針刺組、針刺+ TMP組，每組10只。

1.2 藥品和試劑 鹽酸川芎嗪：北京市燕京制藥廠，批號(hào)：050701；硫酸慶大霉素注射液，每支2mL含GM 80mg，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥標(biāo)字H42020030；MDA測(cè)定試劑盒，批號(hào)：20081105；TSOD測(cè)定試劑盒，批號(hào)：20081111。

1.3 電針及給藥方法 正常對(duì)照組每天按2.5mL/kg劑量腹腔注射生理鹽水，其余各組每天腹腔注射慶大霉素100mg/kg，連續(xù)14天；TMP組同時(shí)灌服川芎嗪200mg/kg；針刺組同時(shí)針刺雙側(cè)聽(tīng)宮、翳風(fēng)、外關(guān)[4]（穴位參照文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖學(xué)與人體穴位相應(yīng)部位[5]），連續(xù)輸出，刺激強(qiáng)度動(dòng)物能忍受為度，持續(xù)刺激20min；TMP+針刺組先針刺雙側(cè)聽(tīng)宮、翳風(fēng)、外關(guān)（方法同針刺組），針刺后立即灌服川芎嗪，劑量同TMP組；各組動(dòng)物均連續(xù)針刺和（或）用藥14天，每天測(cè)量體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量，直至造模完成。根據(jù)ABR測(cè)定確定造模是否成功[2，6]。

1.4 ABR檢測(cè)聽(tīng)反應(yīng)閾 用藥前及連續(xù)用藥14天后的第1天檢測(cè)雙耳ABR。動(dòng)物在戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉后，記錄電極置顱頂正中，參考電極及接地電極分別置于給聲耳及對(duì)側(cè)耳后乳突部皮下。用ZEP型聲刺激器，采用短聲（click）刺激，掃描時(shí)間10ms，疊加512次，帶通濾波100～3 000Hz，在屏蔽隔聲室內(nèi)常規(guī)測(cè)試。

1.5 耳蝸組織SOD活力和MDA含量測(cè)定 各組豚鼠停藥后第一天測(cè)試。ABR后，迅速斷頭處死豚鼠取出聽(tīng)泡，蝸?lái)敶檀?，在解剖顯微鏡下于0～4℃生理鹽水中剔除蝸殼，將蝸軸連同膜蝸管取下，雙耳合為一份標(biāo)本放入離心管內(nèi)。加入10倍體積生理鹽水，用DLAX 900型勻漿機(jī)將上述組織研碎制成勻漿。4℃下離心10min（4 000r/min）后，分別取上清液0.1mL，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定和硫代巴比妥酸法測(cè)定耳蝸組織中T-SOD活力和MDA含量。SOD活力單位

2 結(jié) 果

2.1 ABR檢測(cè)聽(tīng)反應(yīng)閾 治療后正常組與模型組ABR閾值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），顯示造模成功，見(jiàn)表1。

表1 用藥前后豚鼠ABR閾值比較（±s）

注：與用藥前比較，△P＜0.01；與正常組比較，*P＜0.01

?

2.2 各組豚鼠血清MDA表達(dá)吸光值比較 正常組、各治療組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），TMP+針刺組與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；正常組與TMP組、針刺組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；針刺組與TMP組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組豚鼠血清MDA表達(dá)吸光值（±s）

注：與TMP+針刺組比較，▲P＜0.01；與模型組比較，☆P＜0.01

2.3 各組豚鼠血清SOD表達(dá)比較 模型組與正常組、針刺組及TMP+針刺組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；TMP組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；正常組與各治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各治療組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組豚鼠血清SOD表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，☆P＜0.01

組別n/只SOD正常組模型組TMP組針刺組TMP+針刺組10 10 10 10 10 131.33±4.06☆121.49±3.02 129.20±8.29 139.53±9.98☆166.57±9.42☆

3 討 論

氨基糖苷類(lèi)抗生素對(duì)聽(tīng)力損失的病理表現(xiàn)在耳蝸毛細(xì)胞破壞，尤其是外毛細(xì)胞最易受損。造成其損傷的毒性機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)線粒體蛋白質(zhì)合成和氧自由基的形成障礙所致。氨基糖苷類(lèi)抗生素可以通過(guò)激活一氧化氮合酶，增加一氧化氮的濃度，使內(nèi)耳產(chǎn)生自由基。SODs是體內(nèi)最主要和最常見(jiàn)的抗氧化系統(tǒng)，對(duì)機(jī)體氧化和抗平衡起著至關(guān)重要的作用，它可歧化超氧陰離子生成H2O2，從而消除其毒性，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。因此，SOD間接反映了體內(nèi)清除氧自由基的能力；MDA則是過(guò)多的氧自由基積累引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，它能造成神經(jīng)細(xì)胞的裂變死亡。

Priuska等[7]報(bào)道GM可通過(guò)與鐵形成GM-鐵復(fù)合物而具有氧化還原活性，該復(fù)合物在體外和完整細(xì)胞內(nèi)都能催生產(chǎn)生超氧陰離子，進(jìn)而損傷毛細(xì)胞，導(dǎo)致聽(tīng)力障礙。本實(shí)驗(yàn)中，模型組SOD活性降低，MDA增加，提示GM中毒后，耳蝸內(nèi)超氧陰離子增多，SOD活性降低，脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA增加，這也與陳賢明等[8]研究結(jié)論相一致。

川芎嗪是中藥川芎的有效成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪（TMP），可通過(guò)血液、耳蝸外淋巴液及腦脊液三種途徑直接作用于耳蝸和聽(tīng)神經(jīng)。它可通過(guò)清除氧自由基及改善內(nèi)耳血管紋循環(huán)，改善聽(tīng)力。崔城等報(bào)道[9]，中藥川芎嗪可以改善慶大霉素中毒導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聾聽(tīng)覺(jué)功能。

本實(shí)驗(yàn)針刺選用聽(tīng)宮、翳風(fēng)和外關(guān)穴三穴。聽(tīng)宮為近端取穴是手足少陽(yáng)、手太陽(yáng)經(jīng)的會(huì)穴，是治療耳聾的特效穴；翳風(fēng)是手足少陽(yáng)之會(huì)穴，針刺可起到改善局部血管營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)調(diào)節(jié)的作用。外關(guān)穴為手少陽(yáng)絡(luò)穴，又為八脈交會(huì)穴《針灸大成》“主耳聾，渾渾淳淳無(wú)聞，五指盡痛，不能握物”手足少陽(yáng)經(jīng)均“從耳后入耳，出走耳前”，手太陽(yáng)經(jīng)脈“卻入耳中”，三穴合用有聰耳開(kāi)竅之功效，可改善機(jī)體新陳代謝，激發(fā)細(xì)胞活性，從而增強(qiáng)藥物在機(jī)體內(nèi)的靶向效應(yīng)[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慶大霉素能引起組織內(nèi)氧自由基的增多，SOD活性降低，MDA含量升高，各治療組均能不同程度的拮抗慶大霉素的作用。治療后除TMP組，其他各治療組SOD的活性較模型組有明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；各治療組MDA均明顯降低，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；針刺配合川芎嗪組效果最佳（P＜0.01）。另外，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺加川芎可通過(guò)抑制Bax蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白表達(dá)，而達(dá)到對(duì)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[11]。由于Bcl-2蛋白存在線粒體內(nèi)膜部位，這個(gè)部位又因多聚不飽和脂肪酸含量較多易被攻擊而成為活性氧產(chǎn)生的主要場(chǎng)所。因此，Bcl-2具有抗氧化作用并可通過(guò)抑制活性氧形成而抑制細(xì)胞凋亡。據(jù)此我們可以推斷，針刺加川芎對(duì)耳毒性保護(hù)存在多種相互關(guān)聯(lián)的內(nèi)在機(jī)制，可能通過(guò)增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)，提高SOD活性，抑制自由基的產(chǎn)生，以對(duì)抗藥物對(duì)耳神經(jīng)所造成的損傷。

由此可見(jiàn)，針灸配合川芎嗪可以減少急性藥物性聾豚鼠MDA的表達(dá)，增強(qiáng)SOD活性，從而抑制自由基生成，保護(hù)耳蝸免受損傷。

［1］王愛(ài)梅，湯浩，沈靜，等.丹參注射液對(duì)慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸氧自由基生成的影響［J］.中國(guó)應(yīng)用生理雜志，2004，20（4）：406-408.

［2］趙烏蘭，王永華，王楓.針刺及川芎嗪對(duì)急性藥物性聾豚鼠耳蝸生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43表達(dá)的影響［J］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，32（6）：793-795.

［3］成澤東，陳以國(guó).針刺對(duì)大鼠體內(nèi)中藥有效成分（TMP）趨向性影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)針灸，2002，22（1）：5133.

［4］付平，王順金.針刺治療對(duì)藥物性耳聾病理形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.北京針灸骨傷學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，6（2）：7-8.

［5］李辭蓉，華興邦，周浩良，等.豚鼠針灸穴位圖譜的研制［J］.上海針灸雜志，1992，21（2）：28-31.

［6］鄭華平，王楓，徐泉珍，等.針刺對(duì)川芎嗪防治豚鼠慶大霉素中毒性耳聾靶向作用的影響［J］.中國(guó)針灸，2008，28（7）：515-518.

［7］Priuska EM，Schacht J.Formation of free radicals by gentamicin and iron and evidence for an iron/gentamicin complex［J］.Biochem pharmacoi，1995，50：1749-1752.

［8］陳賢明.王錦玲，姜鴻彥,等.水楊酸鈉降低慶大霉索所致耳蝸?zhàn)杂苫康膶?shí)驗(yàn)研究［J］.聽(tīng)力學(xué)及言語(yǔ)疾病雜志，2000，8（2）：68-70.

［9］崔城，湯浩，崔桂英，等.川芎嗪拮抗慶大霉素耳毒性作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.現(xiàn)代康復(fù)，2001，5（2）：53-54.

［10］鄭華平，王楓，徐飛，等.針刺對(duì)川芎嗪防治豚鼠慶大霉素中毒性耳聾靶向作用的影響［J］.中國(guó)針灸，2008，28（7）：515-518.

［11］王永華,劉金洪，王楓，等.針刺及川芎嗪對(duì)慶大霉素致耳聾豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及調(diào)控基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合耳鼻喉科雜志，2007，15（5）：321-325.

Effects of Tetramethylpyrazine and Acupuncture on Cochlear Free Radical Expression of Piunea Pigs with AcuteDrug-induced Deafness

HAN Mingxun，ZHAO Wu
lan，WANG Yiming，et al.The Rehabilitation Institute For the Deaf ZJUTCM，Hangzhou(310053)，China

Objective：To investigate the effect of acupuncture and tetramethylpyrazine（TMP）on cochlear free radical expression of mice with acute drug-induced deafness.Methods：Fifty guinea pigs were randomly divided into 5 groups，including normal，model，TMP alone，acupuncture alone，and TMP plus acupuncture groups，10 animals in each group.Each group

different procedures.The normal group was prepared by consecutively intraperitoneal injection with normal saline of 2.5 mL/（kg·d）.Acute drug-induced deafness was made by consecutively in traperitoneal injection with gentamycin（100 mg/kg·d）in other groups.All groups were injected for consecutive 14 days.Before and 1 day after 14-day injection,the mice were tested ABR to identify whether the models were successful.The methods of thiobarbituric acid and xanthine oxidase were used to test serum malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（T-SOD）.Results：The expression of MDA was reduced in all treatment groups as compared with that of the model group（P＜0.01），with the most reduction seen in the TMP plus acupuncture group.The activity of SOD was enhanced in all treatment group，but with no significant difference among the treatment groups（P＞0.05）.Conclusion：TMP plus acupuncture can effectively increase the activity of SOD and reduce the expression of MDA in the cochlear tissue.They may have effect against gentamycin-induced inner ear diseases.

piunea pigs drug-induced deafness tetramethylpyrazine acupuncture free radical formation

2013-07-02

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目（No.81173309）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2010ZA015）

王永華，Tel：13606626396；E-Mail：wangyh@vip.sina.com