硫磺熏制對杭白菊總黃酮含量的影響

徐莉莉 浙江省金華市金東區(qū)中醫(yī)院中藥房 金華 321031

·藥學(xué)園地·

硫磺熏制對杭白菊總黃酮含量的影響

徐莉莉 浙江省金華市金東區(qū)中醫(yī)院中藥房 金華 321031

杭白菊 硫磺熏制 總黃酮

杭白菊又稱杭菊，是菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序，為《中國藥典》所收載[1]，是著名的“浙八味”之一，具有散風(fēng)清熱，平肝明目、清熱解毒功效，用于風(fēng)熱感冒，頭痛眩暈，目赤腫痛，眼目昏花，瘡癰腫毒等癥，是臨床常用中藥。菊花的主要有效成分為黃酮、三萜、揮發(fā)油等[2]，菊花總黃酮具有抗氧化[3-4]、降血壓、擴(kuò)張冠狀動脈[5-7]等作用，是杭白菊主要藥效物質(zhì)，具有較大的藥用和保健價值。

硫磺熏蒸是一種在中藥材及飲片的加工和貯藏過程中應(yīng)用較為普遍的加工方法，具有干燥、防蟲、防霉以及增白等作用[8]，但是由于硫磺熏蒸使杭白菊殘留大量的二氧化硫，且導(dǎo)致有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量發(fā)生改變[9-10]，影響杭白菊臨床應(yīng)用的安全性和有效性。本實(shí)驗(yàn)采用可見紫外分光光度法測定杭白菊硫磺熏制前后總黃酮含量，為優(yōu)化杭白菊的炮制加工方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試劑與藥材 蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號100080-201106）；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉為分析純。杭白菊：采集于浙江桐鄉(xiāng)，經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院羅國海副教授鑒定為菊科植物Chrysanthemum morifolium Ramat.的新鮮頭狀花序；分別采用傳統(tǒng)蒸制干燥、一次硫磺熏制、二次硫磺熏制法制備成杭白菊干燥品，粉碎，過2號篩備用。

1.2 儀 器 VU-265FM紫外可見分光光度計(jì)（日本島津），HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司），XP205電子分析天平（瑞士梅特勒托利多）。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液和供試品溶液的制備 精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品約25mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取20mL，置50mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得（每1mL中含無水蘆丁0.224mg）。取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇50mL，稱重，回流提取1h，放涼，稱重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 最大吸收波長的選擇 精密吸取蘆丁對照品溶液和杭白菊供試品溶液各1mL，分別置于25mL量瓶中，各加入70%乙醇至6mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，于400～600nm掃描，結(jié)果在504nm處有最大吸收。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分別置于25mL容量瓶中，各加入70%乙醇至6mL，然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min；加入10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min；加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外-可見分光光度法（2010版中國藥典一部附錄ⅤA），于504nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得吸光度Y與蘆丁濃度X的回歸方程:A=9.486X+0.04，R2=0.9990。

2.4 提取工藝優(yōu)選 通過預(yù)試驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，影響杭白菊總黃酮提取的主要因素有提取方法、乙醇濃度、溶劑用量和提取時間。因此，對四個因素進(jìn)行單因素考察。

2.4.1 提取方法 取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，分別置100mL圓底燒瓶中，精密加入50%乙醇50mL，稱重，分別超聲30min、60min，回流30min、60min，放涼，稱重，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液1mL，分別置25mL量瓶中，照“2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下的方法，自“加70%乙醇至6mL”起依法測定吸光度，計(jì)算，即得。結(jié)果分別為，超聲30min含量為6.25%、60min為6.63%，回流30min為6.84%、60min為7.15%，結(jié)果表明，回流提取的黃酮含量高于超聲提取，因此，選擇回流為杭白菊總黃酮提取方法。

2.4.2 乙醇濃度考察 取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，分別精密加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇50mL，稱重，回流提取，放涼，稱重，用相應(yīng)濃度的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照前述述方法進(jìn)行測定。結(jié)果乙醇濃度在50%～80%范圍內(nèi)時，測得總黃酮含量較高，且乙醇濃度為70%時，測得的總黃酮含量最高，為8.36%。因此，將乙醇濃度確定70%。

2.4.3 提取時間考察 取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇各50mL，稱重，分別回流提取0.25、0.5、1和1.5h，放涼，稱重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照前述方法進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著回流時間的延長總黃酮含量增加，當(dāng)回流時間大于1h時，總黃酮含量增加不明顯，因此，將提取時間確定為1h。

2.4.4 溶劑用量考察 取杭白菊粉末約0.5g，精密稱定，置100mL圓底燒瓶中，分別精密加入70%乙醇40、50、60和70mL，稱重，分別回流提取1h，放涼，稱重，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。照前述方法進(jìn)行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶劑超過50 mL時，總黃酮含量變化不大。因此，確定溶劑用量為50 mL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液4mL，供試品溶液1mL，置于25mL量瓶中，同“2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，測定吸光度，測定六次。對照品溶液及供試品溶液吸光度的RSD分別為0.21%和0.18%，說明精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對照品溶液4mL，供試品溶液1mL，置于25mL量瓶中，同“2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下，自“加70%乙醇至6mL”起，同法操作，每隔10min測定一次吸光度。對照品溶液及供試品溶液吸光度的 RSD分別為 2.22%和2.39%，RSD均小于3%，結(jié)果表明對照品溶液和供試品溶液顯色后在1h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取杭白菊粉末6份，照“2.2對照品溶液和供試品溶液的制備”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，照前述含量測定方法進(jìn)行測定，測得總黃酮含量平均值為8.39%，RSD值為1.36%，表明本法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法試驗(yàn)。取已知總黃酮含量的杭白菊0.25g，精密稱定，共取6份，分別準(zhǔn)確加入蘆丁對照品適量，照“2.2對照品溶液和供試品溶液的制備”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，制備成供試品溶液，照前述含量測定方法進(jìn)行測定，計(jì)算回收率。試驗(yàn)結(jié)果表明，蘆丁平均回收率為99.6%%（n=6），RSD為2.63%。說明測定結(jié)果準(zhǔn)確。結(jié)果見表1。

2.6 樣品測定 分別稱取杭白菊傳統(tǒng)蒸制干燥、一次硫熏、二次硫熏樣品粉末三份，每份0.5g，精密稱定，照“2.2對照品溶液和供試品溶液的制備”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，照前述含量測定方法進(jìn)行測定。結(jié)果見表2。

3 討 論

通過對杭白菊總黃酮含量的測定發(fā)現(xiàn)，硫磺熏制與傳統(tǒng)蒸制干燥的杭白菊相比黃酮含量有較大幅度的下降，一次熏制下降約25%，二次熏制下降接近40%。在總黃酮的含量測定中，利用Al（NO3）3溶液與黃酮絡(luò)合顯色，鋁離子與4-羰基、5-羥基或4-羰基、3-羥基絡(luò)合，在堿性條件下呈紅色，在510nm左右有最大吸收。而硫熏過程中，產(chǎn)生的大量二氧化硫，可能與酚羥基發(fā)生反應(yīng)，生成亞硫酸酯，從而難以與鋁離子產(chǎn)生絡(luò)合，可能是硫磺熏制后總黃酮檢測結(jié)果大幅降低的原因。

總黃酮為杭白菊主要有效部位，具有抗氧化、降血壓、擴(kuò)張冠狀動脈等作用，是杭菊主要藥效物質(zhì)。黃酮類成分一般含有酚羥基，是其發(fā)揮藥理活性的重要官能團(tuán)。硫熏過程中，酚羥基可能發(fā)生酯化，從而使黃酮類成分喪失相應(yīng)的藥理作用，降低療效。

本試驗(yàn)結(jié)果提示應(yīng)當(dāng)限制硫磺熏蒸在杭白菊加工過程中的使用，應(yīng)采用化學(xué)手段對硫磺熏制后黃酮類化學(xué)成分的變化進(jìn)行確認(rèn)，并對總黃酮硫熏后的毒理作用、藥理活性進(jìn)行考察，為確定杭白菊更合理的加工炮制方法提供科學(xué)依據(jù)。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：292.

［2］黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1994：1565.

［3］張爾賢，方黎，張捷，等.菊花提取物的抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2000，7（4）：6-8.

［4］張片紅，唐滬強(qiáng)，鄭鳴之，等.杭白菊總黃酮對衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2011，27（3）：368-371.

［5］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986：563-564.

［6］蔣惠娣，王玲，周新妹，等.杭白菊乙酸乙酯提取物的舒血管作用及相關(guān)機(jī)制［J］.中國病理生理雜志，2005，21（2）：334-338.

［7］張瑋，葉治國，崔潔，等.杭白菊乙酸乙酯提取物對大鼠實(shí)驗(yàn)性心律失常的影響及其機(jī)制［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，38（4）：377-382.

［8］劉靜靜，劉曉，李松林，等.硫磺熏蒸中藥材及飲片的研究現(xiàn)狀［J］.中草藥，2010，41（8）：1403-1406.

［9］王亞君，郭巧生，楊秀偉，等.小亳菊及其硫磺熏制品揮發(fā)油成分的GC-MS分析［J］.中國中藥雜志，2007，32（9）：808-813.

［10］劉曉，蔡皓，馬曉青，等.硫磺熏蒸前后菊花的HPLC指紋圖譜比較研究［J］.中藥材，2010，35（5）：705-708.

2013-04-12