VEGF對新生大鼠細(xì)菌性腦膜炎病理進(jìn)程的影響

鄒華芳

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，廣東 湛江 524000)

新生兒細(xì)菌性腦膜炎(bacterial meningitis, BM)是嚴(yán)重威脅新生兒健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)感染性疾病，其病死率可達(dá)10%～15%，幸存者中20%～50% 留有癲癇、認(rèn)知缺陷、聽力喪失、視覺缺損、行為發(fā)育異常等嚴(yán)重的后遺癥[1-2]。迄今為止，該病對CNS損傷的機(jī)制仍不十分清楚。因此，進(jìn)一步深入探討新生兒BM發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是在生長發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤生長、局部缺血等病理變化過程中具有促進(jìn)血管增生、增加血管滲透性的重要調(diào)節(jié)因子，故可通過抑制VEGF的表達(dá)來降低血管滲透性，從而達(dá)到緩解疾病惡化的目的[3-4]。多項研究[5-6]表明，在炎癥反應(yīng)過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的VEGF亦有不同程度的升高，血管滲透性增加，使更多炎癥因子穿過血管管壁參與炎癥反應(yīng)，加重了CNS的炎癥損傷。同時，VEGF也參與炎癥損傷后的修復(fù)和血管的新生，而新生兒血-腦屏障通透性的增加是病原體能夠進(jìn)入顱內(nèi)引起腦炎的重要前提。相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]證實，在各種病原體引起的腦膜炎中，血-腦屏障通透性的增加與VEGF有關(guān)，故研究VEGF在新生兒BM病理進(jìn)展中的變化關(guān)系，對臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究通過建立新生大鼠BM模型，檢測不同時間點(diǎn)腦脊液(CSF)中WBC計數(shù)、腦組織中VEGF mRNA、VEGF蛋白表達(dá)水平，以及動物臨床表現(xiàn)的觀察，并對神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評分，以探討VEGF與新生兒BM發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，期望為臨床治療提供新思路和可靠的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.2實驗動物及分組 同窩出生SD第11天齡新生大鼠150只，雌雄兼有，體質(zhì)量14.1～21.2 g(17.9±2.3)g，新生大鼠隨母鼠一起購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物學(xué)部(符合國家二級動物標(biāo)準(zhǔn))，動物合格證號：醫(yī)動字第20-010號。將150只新生大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：正常對照組(38只)、生理鹽水對照組(NS對照組，42只)和實驗組(70只)。

1.2實驗方法

1.2.1致病菌的制備 首先，將GBSⅢ 干燥菌種使用血清肉湯培養(yǎng)基37 ℃ 培養(yǎng)24 h后，接種于血平皿。18～24 h后，挑取單個GBSⅢ 菌落于血清肉湯培養(yǎng)基中，至對數(shù)生長中期收集GBSⅢ 菌液。然后，通過紫外分光光度儀檢測GBSⅢ菌液的濁度，調(diào)整GBSⅢ菌液的濁度對應(yīng)的OD值與1/2標(biāo)準(zhǔn)比濁管(體積分?jǐn)?shù)為1×108cfu·ml-1)相同，得出菌液體積分?jǐn)?shù)為108cfu·ml-1，再稀釋菌液至體積分?jǐn)?shù)為104cfu·ml-1。

1.2.2實驗動物模型的建立 按文獻(xiàn)[10]的方法，實驗組、NS對照組采用1.0%戊巴比妥鈉 15～25 mg·kg-1腹腔注射，麻醉。麻醉后，用10 μl穿刺針于小腦延髓池處穿刺，抽出10 μl腦脊液棄去。然后，實驗組注入10 μl GBSⅢ 菌液，NS對照組注入10 μl無菌生理鹽水，整個操作過程在1～2 min內(nèi)完成。待復(fù)蘇后，放回鼠籠由母鼠繼續(xù)喂養(yǎng)。正常對照組不作任何處理。分別于≤16、>16～≤24、>24～≤48、>48～≤72 h 3組各抽取8只存活的新生大鼠進(jìn)行取材，抽取新生大鼠腦脊液行WBC計數(shù)、腦組織行VEGF mRNA檢測，并取腦組織行免疫組織化學(xué)方法檢測VEGF蛋白的水平。

1.2.3神經(jīng)行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn) 分別于≤16、>16～≤24、>24～≤48、>48～≤72 h 從3組存活的新生大鼠中各抽取8只進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分：抓其背部，能正常運(yùn)動，并在5 s內(nèi)翻身為5分；5 s內(nèi)翻身，但自發(fā)性運(yùn)動減少為4分；5 s后出現(xiàn)翻身為3分；不能翻身為2分；不能運(yùn)動為1分[11]。

1.2.4CSF中WBC計數(shù) 取3組進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分后的新生大鼠各8只，采用1.0%戊巴比妥鈉 15～25 mg·kg-1腹腔注射，麻醉。麻醉后，用10 μl 穿刺針于新生大鼠小腦延髓池垂直進(jìn)針。有突破感時，回抽取 CSF，取10 μl CSF 置入改良Neubauer計數(shù)板的計數(shù)池行WBC計數(shù)。

1.2.5實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)檢測腦組織中VEGF mRNA 表達(dá)水平 引物設(shè)計與合成：根據(jù) Genebank的資料[12]確定VEGF和β-actin的引物，β-actin作為各標(biāo)本的內(nèi)對照。引物(由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA合成)序列如下：1)VEGF引物，上游： 5′-GCA ATG ATG AAG CCC TGG AG-3′，下游：5′-GGT GAG GTT TGA TCC GCA TG-3′，產(chǎn)物大小78 bp；2)β-actin引物，上游：5′-TGA CAG GAT GCA GAA GGA GAT TAC-3′，下游：5′-GGA CAG TGA GGC CAG GAT AGA G-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為120 bp。

腦組織中RNA的提取和PCR產(chǎn)物合成：取3組存活的新生大鼠各8只，斷頸處死后，取50 mg腦組織迅速加入Trizol試劑 1 ml，參照Trizol試劑說明提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成參照Taka逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明。PCR反應(yīng)體系：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共31個循環(huán)，最后一個循環(huán)再72℃延伸10 min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，120 V電泳40 min。應(yīng)用Eagle EyeⅡ凝膠成像系統(tǒng)分析，測定PCR產(chǎn)物VEGF cDNA條帶和β-actin內(nèi)對照條帶的吸光度比值(D/D0)作為VEGF mRNA的相對表達(dá)量。

對比探究2和探究3不難發(fā)現(xiàn)，兩次實驗唯一不同的是，探究2的饅頭是用錫紙包裹的，而探究3的饅頭沒有用錫紙包裹，從而得出造成微波爐不能正常工作的是錫紙?？墒?，錫紙為什么能造成微波爐里出現(xiàn)火花呢？

1.2.6免疫組織化學(xué)方法檢測腦組織中VEGF蛋白表達(dá)水平 病理切片的制作：分別于≤16、>16～≤24、>24～≤48、>48～≤72 h 從3組存活的新生大鼠中各抽取4只，采用1.0%戊巴比妥鈉致死量( 40～60 mg·kg-1)腹腔注射，處死。開胸暴露心臟，用7號頭皮針將40～60 ml生理鹽水灌入左心室，直至右心耳流出無色清亮液體, 肝臟變白。再用4.0%多聚甲醛液40 ml灌注, 觀察肝臟變硬即可。用無菌手術(shù)剪沿后囟剪開顱骨, 取出腦組織，置于4%多聚甲醛液中4 ℃ 冰箱固定4 h。然后，乙醇脫水，二甲笨透明，石蠟包埋，冠狀切面自額葉向后切片, 切片厚35 μm。

免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：從每只新生大鼠腦組織切片中抽取5張切片。脫蠟和水化后，用PBS沖洗3 min，沖洗3次。EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行高壓修復(fù)1.5 min。室溫冷卻后，用PBS沖洗3 min，沖洗3次。加50 μl的一抗山羊抗大鼠VEGF抗體，37℃孵育60 min。再置4℃冰箱過夜,取出，用PBS沖洗3 min，沖洗3次。加入50 μl的二抗，37℃孵育30 min。用PBS沖洗30 min，沖洗3次。DAB顯色3 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察3～5 min。流水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片。以胞漿、組織間質(zhì)有黃色顆粒沉積為陽性染色。在光學(xué)顯微鏡的高倍鏡下隨機(jī)觀察5個視野，以陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度為判定標(biāo)準(zhǔn)。陽性細(xì)胞百分率[陽性細(xì)胞百分率=(陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%]。判定陰性(-)：染色細(xì)胞數(shù)<10%；弱陽性(±)：陽性細(xì)胞數(shù)10%～40%，染色淺淡；陽性(+)：陽性細(xì)胞數(shù)在40%～80%之間，染色強(qiáng)度中等；強(qiáng)陽性(++)：陽性細(xì)胞數(shù)>80%，染色較深。

1.2.7動物臨床表現(xiàn)的觀察及抽搐程度判斷標(biāo)準(zhǔn) 動物臨床表現(xiàn)的觀察：觀察3組新生大鼠死亡、有無口唇及四肢末端發(fā)紺、呼吸困難、反應(yīng)遲鈍及抽搐的情況。

按文獻(xiàn)[13]的癲癇動物抽搐分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抽搐程度判斷：0級為無抽搐；Ⅰ級為面部陣攣；Ⅱ級為Ⅰ級+節(jié)律點(diǎn)頭；Ⅲ級為Ⅱ級+前肢陣攣；Ⅳ級為Ⅲ級+后肢站立；Ⅴ級為Ⅳ級+跌倒。

2 結(jié) 果

2.1動物臨床表現(xiàn) 正常對照組、NS對照組新生大鼠在≤16、>16～≤24、>24～≤48、>48～≤72 h時均未出現(xiàn)死亡、口唇及四肢末端發(fā)紺、呼吸困難、反應(yīng)遲鈍及抽搐。實驗組新生大鼠臨床表現(xiàn)見表1。

表1 實驗組不同時間點(diǎn)的臨床表現(xiàn)情況

2.2神經(jīng)行為學(xué)評分

正常對照組新生大鼠在≤16、>16～≤24、>24～≤48、>48～≤72 h時神經(jīng)行為學(xué)評分值與NS對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，實驗組新生大鼠在≤16、>16～≤24、>24～≤48、>48～≤72 h時神經(jīng)行為學(xué)評分值均明顯低于正常對照組、NS對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組不同時間點(diǎn)的神經(jīng)行為學(xué)評分比較分)

注：#P>0.05與正常對照組比較，*P<0.05與正常對照組、NS對照組比較。

2.3CSF中WBC計數(shù)

NS對照組新生大鼠在≤16 h時CSF中 WBC計數(shù)值與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組新生大鼠在≤16、>16～≤24、>24～≤48、>48～≤72 h時CSF中 WBC計數(shù)值均明顯高于正常對照組、NS對照組(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 各組不同時間點(diǎn)的CSF中 WBC計數(shù)比較

注：-：無此項；#P>0.05與正常對照組比較，*P<0.05、**P<0.01與正常對照組、NS對照組比較。

2.4腦組織中VEGF mRNA表達(dá)水平 各組新生大鼠腦組織中均可檢測到內(nèi)參照基因β-actin的穩(wěn)定表達(dá)。3組新生大鼠PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，VEGF基因片段PCR 產(chǎn)物( 長度為78bp)和β-actin基因片段PCR 產(chǎn)物(長度為 120 bp), 證實了逆轉(zhuǎn)錄cDNA 的完整性(圖1)。NS對照組新生大鼠在≤16 h 時腦組織中 VEGF mRNA 表達(dá)水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組新生大鼠在≤16、>16～≤24、>24～≤48、>48～≤72 h時腦組織中 VEGF mRNA 表達(dá)水平均明顯高于正常對照組、NS對照組(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 各組不同時間點(diǎn)的腦組織中VEGF mRNA表達(dá)水平比較

注：-：無此項；#P>0.05與正常對照組比較，*P<0.05、**P<0.01與正常對照組、NS對照組比較。

2.5腦組織中VEGF mRNA表達(dá)水平與CSF中的WBC計數(shù)、動物神經(jīng)行為學(xué)評分的相關(guān)性 實驗組新生大鼠腦組織中VEGF mRNA表達(dá)水平與CSF中的 WBC計數(shù)、動物神經(jīng)行為學(xué)評分均無相關(guān)性(r=0.405、-0.548，均P>0.05),實驗組新生大鼠CSF 中的WBC計數(shù)與神經(jīng)行為評分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.980，P<0.05)。

2.6腦組織中VEGF蛋白表達(dá)水平 NS對照組新生大鼠在≤16 h 時腦組織中VEGF蛋白表達(dá)水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組新生大鼠在≤16、>16～≤24、>24～≤48、>48～≤72 h時腦組織中VEGF蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對照組、NS對照組(P<0.05或P<0.01)。見表5。

表5 各組不同時間點(diǎn)的腦組織中VEGF蛋白表達(dá)水平比較

注：-：無此項；#P>0.05與正常對照組比較，*P<0.05、**P<0.01與正常對照組、NS對照組比較。

光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，正常對照組未見明顯的VEGF蛋白陽性染色，NS對照組≤16 h VEGF蛋白陽性染色細(xì)胞數(shù)目少。實驗組在≤16 h 時腦室腔中性粒細(xì)胞呈VEGF蛋白陽性染色，腦室腔中性粒細(xì)胞、纖維結(jié)締組織呈VEGF的陽性染色，實驗組在>16～≤24 h時腦膜、淺皮質(zhì)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞呈VEGF蛋白陽性染色，大腦皮質(zhì)呈VEGF陽性染色的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞，實驗組在>24～≤48 h 時脈絡(luò)膜叢、纖維結(jié)締組織呈VEGF蛋白陽性染色，脈絡(luò)膜叢血管炎性損傷區(qū)周圍、纖維結(jié)締組織VEGF陽性染色，實驗組在>48～≤72 h時海馬齒狀回顆粒細(xì)胞周圍呈VEGF蛋白陽性染色，海馬顆粒狀細(xì)胞周圍呈VEGF陽性染色。見圖2。

1：正常對照組； 2：實驗組≤16 h；3:實驗組>16～≤24 h；4：NS對照組； 5：實驗組>24～≤48 h；6：實驗組>48～≤72 h

圖1 各組RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳圖

A：正常對照組；B：NS對照組≤16 h；C：實驗組≤16 h；D：實驗組>16～≤24 h；E：實驗組>24～≤48 h；F：實驗組>48～≤72 h。

圖2 腦組織中VEGF蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色)

3 討 論

近年來，國外在成人、兒童腦膜炎及成年大鼠腦膜炎模型研究中發(fā)現(xiàn)VEGF表達(dá)水平增高[7,14-15]，但在新生兒BM中VEGF表達(dá)情況國內(nèi)外尚無報道。本實驗通過將GBSⅢ菌液直接注入新生大鼠小腦延髓池，成功建立新生大鼠BM模型，且病理學(xué)改變、動物表現(xiàn)、實驗室檢查均證實這一點(diǎn)[10]，并在此動物模型基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究VEGF與新生鼠BM發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。

3.1VEGF在新生大鼠BM中的表達(dá)水平 本研究觀察了VEGF mRNA及VEGF蛋白在新生大鼠BM病程變化中不同時間點(diǎn)的表達(dá)情況，通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，新生大鼠接種GBSⅢ 菌液后腦組織中VEGF mRNA 表達(dá)一直處于升高趨勢，直至模型72 h達(dá)到高值，與正常對照組、NS對照組比較，其升高有明顯差異，且免疫組織化學(xué)VEGF蛋白染色與之相符，陽性細(xì)胞比例及表達(dá)強(qiáng)度逐漸升高。Flier等[16]在成人BM的研究中發(fā)現(xiàn)，CSF 中VEGF表達(dá)水平升高，腦組織病理標(biāo)本上中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞呈VEGF陽性染色，可能的機(jī)制是：BM的早期，細(xì)菌及其產(chǎn)物引發(fā)宿主的炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞)和血小板等均可產(chǎn)生VEGF。同時，炎性細(xì)胞釋放出多種細(xì)胞因子，如TNF-α、血小板源性生長因子、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-1、IL-6、γ-干擾素等，均能使VEGF和其受體表達(dá)增高，提高其生物學(xué)活性[2-3,16]。這些細(xì)胞因子通過增強(qiáng)VEGF的生成及表達(dá)引起血管通透性增高，并且VEGF與這些細(xì)胞因子相互作用，促進(jìn)了宿主的炎癥反應(yīng)[16]。文獻(xiàn)[17-18]報道，VEGF通過：1)使得血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密聯(lián)結(jié)蛋白重新排列，造成血-腦屏障滲透性增高，并促使基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)增加，引起血-腦屏障損傷；2)引起血管通透性增高、導(dǎo)致血管性腦水腫；3)損傷血-腦屏障，使正常隱蔽的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗原與血源性免疫介質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，通過增加血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1和主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ的表達(dá)等，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)。VEGF通過多種途徑參與BM的進(jìn)程。故本實驗新生大鼠VEGF表達(dá)升高，參與BM的炎癥反應(yīng)。

3.2VEGF與炎性細(xì)胞的關(guān)系 有文獻(xiàn)[7-8,17,19]報道，BM、結(jié)核性腦膜炎、隱球菌腦膜炎、嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎患者CSF中VEGF水平及WBC數(shù)均較正常對照組增高。本研究結(jié)果顯示，實驗組CSF中WBC計數(shù)均較正常對照組、NS對照組升高，且在≤16、>16～≤24、>24～≤48 h時呈VEGF陽性染色的細(xì)胞主要為腦室腔、腦膜、大腦皮質(zhì)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞，分析其可能的原因是：本實驗將GBSⅢ菌液直接注入小腦延髓池，細(xì)菌在蛛網(wǎng)膜下腔和腦室內(nèi)大量繁殖，GBS Ⅲ通過莢膜多糖抗原、脂磷壁酸、神經(jīng)氨酸毒力因子[1-2]等引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等浸潤蛛網(wǎng)膜下腔，引起CSF中的WBC數(shù)增高，分泌產(chǎn)生VEGF增加，VEGF則進(jìn)一步引起血管通透性增高，使更多的中性粒細(xì)胞滲出至CSF，導(dǎo)致CSF檢測呈炎性改變，但本研究實驗組新生大鼠腦組織中VEGF mRNA表達(dá)水平與CSF中的 WBC計數(shù)并無相關(guān)性(r=0.405,P>0.05)，其可能的因素有：VEGF除產(chǎn)生于炎性細(xì)胞之外，還可產(chǎn)生于血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞[3]等，并且在BM的病程中VEGF及CSF WBC水平各自持續(xù)時間不同。

3.3VEGF與新生大鼠 BM 病理進(jìn)程的關(guān)系 本研究中，≤24 h時呈VEGF蛋白陽性染色的細(xì)胞以腦室腔、腦膜、大腦皮質(zhì)浸潤的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞為主，而>24 h 時VEGF蛋白陽性染色主要位于脈絡(luò)膜叢血管炎性損傷區(qū)周圍和海馬齒狀回顆粒細(xì)胞，且雖然CSF中WBC計數(shù)逐漸下降，但VEGF mRNA表達(dá)水平仍持續(xù)升高，至>48～≤72 h 時達(dá)一高峰，分析其可能的原因是：在BM的進(jìn)程中，由于炎性細(xì)胞浸潤，內(nèi)皮細(xì)胞增生，廣泛血管痙攣，引起血管管腔狹窄，甚至閉塞，繼發(fā)腦缺血或梗死，均可導(dǎo)致組織缺氧[2]。在缺氧的情況下，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)水平升高，且與VEGF基因5′端啟動子相應(yīng)區(qū)域結(jié)合，啟動VEGF的轉(zhuǎn)錄，使VEGF mRNA水平又進(jìn)一步升高。Yang J等[20]在兔腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，缺血敏感區(qū)皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞上VEGF及HIF-1α表達(dá)增加，推測這可能是機(jī)體對腦缺血的一種保護(hù)機(jī)制: VEGF一方面，促進(jìn)血管生成，增加缺血暗帶區(qū)的血流量。另一方面，拮抗凋亡，發(fā)揮直接神經(jīng)營養(yǎng)和保護(hù)作用，促進(jìn)損傷修復(fù)。本研究中>48～≤72 h時幸存的新生大鼠發(fā)紺、呼吸困難逐漸減少，運(yùn)動功能逐漸好轉(zhuǎn)，抽搐的頻率、程度較前減輕,且此時海馬齒狀回顆粒細(xì)胞周圍呈VEGF蛋白陽性染色，推測此時VEGF的表達(dá)可能與改善局部血供，促進(jìn)神經(jīng)康復(fù)有關(guān)。

總之，新生大鼠BM腦組織中VEGF mRNA表達(dá)水平升高，且隨時間的不同，有逐漸增高的趨勢。新生大鼠BM腦組織在不同時期，表達(dá)VEGF蛋白的部位不同。提示，VEGF表達(dá)異常可能與新生大鼠BM發(fā)病機(jī)制相關(guān)，且在新生大鼠BM的不同時期，VEGF可能起不同的作用。

[1] Baud O, Aujard Y. Neonatal bacterial meningitis[J]. Handb Clin Neurol, 2013, 112:1109-1113.

[2] Waldo E，Nelson.尼爾遜兒科學(xué)[M].第15版.北京:世界圖書出版公司,2002：765-769.

[3] Weis SM, Cheresh DA. Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability[J]. Nature, 2005, 437(7058):497-504.

[4] Weis SM. Evaluation of VEGF-induced vascular permeability in mice[J]. Methods Mol Biol, 2011，763:403-415.

[5] Arnaud L, Haroche J, Duhaut P,et al. Pathogenesis of primary large vessel arteritis[J]. Rev Med Interne,2009, 30(7):578-584.

[6] Easton AS. Regulation of permeability across the blood-brain barrier[J].Adv Exp Med Biol, 2012,763:1-19.

[7] Misra UK, Kalita J, Singh AP,et al. Vascular endothelial growth factor in tuberculous meningitis[J]. Int J Neurosci, 2013,123(2):128-132.

[8] Tsai HC, Liu YC, Lee SS,et al. Vascular endothelial growth factor is associated with blood brain barrier dysfunction in eosinophilic meningitis caused by Angiostrongylus cantonensis infection[J]. Am J Trop Med Hyg, 2007, 76(3):592-595.

[9] van der Flier M, Coenjaerts FE, Mwinzi PN,et al. Antibody neutralization of vascular endothelial growth factor (VEGF) fails to attenuate vascular permeability and brain edema in experimental pneumococcal meningitis[J]. J Neuroimmunol,2005, 160(1-2):170-177.

[10] 趙玲玲,殷萍,鄒華芳.新生SD大鼠細(xì)菌性腦膜炎動物模型的建立[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2006，16(19):2891-2897

[11] Loeffler JM, Ringer R, Hablutzel M, et al. The free radical scavenger (alpha)-phenyl-Tert-butyl nitrone aggravates hippocampal apoptosis and learning deficits in experimental pneumococcal meningitis[J]. J Infect Dis, 2001,183(2):247-252.

[12] Jin M, Zhang Y, Pan L, et al.The Chinese medicine formula HB01 reduces choroidal neovascularization by regulating the expression of vascular endothelial growth factor[J]. J Transl Med, 2012,10:118.

[13] Racine RJ. Modification of seizure active by electrical stimulationⅡmotor seizure[J]. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1972,32: 281-294.

[14] Zucchi FC, Tsanaclis AM, Moura-Dias Q Jr, et al. Modulation of angiogenic factor VEGF by DNA-hsp65 vaccination in a murine CNS tuberculosis model[J].Tuberculosis (Edinb), 2013,93(3):373-380.

[15] van der Flier M, Hoppenreijs S,van Rensburg AJ, et al. Vascular endothelial growth factor And blood-brain barrier disruption in tuberculous meningitis[J]. Pediatr Infect Dis J,2004,23(7):608-613.

[16] Van der Flier M, Stockhammer G, Vonk GJ, et al. Vascular endothelial growth factor in bacterial meningitis: detection in cerebrospinal fluid and localization in postmortem brain[J]. JInfect Dis, 2001, 183(1): 149-153.

[17] Misra UK, Kalita J, Maurya PK. Stroke in tuberculous meningitis[J]. J Neurol Sci, 2011,303(1-2):22-30.

[18] Croll SD, Ransohoff RM, Cai N, et al. VEGF-mediated inflammation precedes angiogenesis in adult brain[J]. Exp Neurol，2004, 187(2):388-402.

[19] Coenjaerts FE, van der Flier M, Mwinzi PN, et al.Intrathecal production and secretion of vascular endothelial growth factor during Cryptococcal Meningitis[J].J Infect Dis, 2004,190(7):1310-1317.

[20] Yang J, Guo L, Liu R, et al. Neuroprotective effects of VEGF administration after focal cerebral ischemia/reperfusion: dose response and time window[J].Neurochem Int, 2012,60(6):592-596.